梨園塊菌多糖提取工藝優化及其單糖組成分析

魯 斌，張鳳明，蔡正達，張 華，于富強,

（1.西南林業大學林學院，云南森林資源培育與利用重點實驗室，云南昆明 650224；2.中國科學院昆明植物研究所，中國西南野生生物種質資源庫，云南省真菌多樣性與綠色發展重點實驗室，云南昆明 650201；3.云南省科學技術院，云南昆明 650228；4.云南邦納科技有限公司，云南昆明 650216）

塊菌Tuber，又稱豬拱菌、無娘果、松毛茯苓等，在商業上常被稱為松露，隸屬子囊菌亞門盤菌目塊菌科，是一類與樹木共生和生長在地下的名貴野生食用菌，因其獨特的香氣，深受國際美食界的喜愛[1?4]。塊菌在北半球有著較廣的分布，在歐洲主要分布在地中海沿岸國家，在我國的分布以云南、四川、西藏等地為主[5]。塊菌子實體含有豐富的多糖、氨基酸、多不飽和脂肪酸和蛋白質等營養成分，在塊菌多糖的研究中，已有研究表明大多數塊菌中的多糖主要組成成分是鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖，也有部分塊菌中存在著特殊種類的多糖組成，如巖藻糖、阿拉伯糖等。在印度塊菌（T.indicum）、夏塊菌（T.aestivum）和棕紅塊菌（T.rufum）的子實體中多糖組成主要包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和巖藻糖等單糖[6?9]。目前，常用的多糖提取方法主要有水浴加熱提取法、酶提取法、微波輔助法、超聲波輔助法、堿提法和酸提法等，其中水提醇沉法已廣泛應用于產業化且方法成熟，此法操作簡單、成本低、能夠最大程度減少多糖在提取過程中水解[10]。由于多糖類物質存在較好的生物活性，具有抗氧化、抗腫瘤、增強免疫力、降血糖和降血脂等功效[11?16]，在食品、藥品和化妝品行業中具有較好的應用前景。

在多糖分析中，由于多糖化合物種類較多、化學性質相似，經硫酸-苯酚、硫酸-蒽酮等顯色反應后，使用紫外分光光度法測定其總多糖含量[17?19]。通常情況下，多糖需要進行酸水解以后使其糖苷鍵斷裂，再通過色譜技術測定水解液中的單糖和含量。目前，常用的色譜分析方法包括薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜法（GC）等多種分析方法[20?22]，因多糖本身存在揮發性和熱穩定性較低等問題，在使用這些分析方法時都會存在著一定的不足之處[23]。例如，采用GC 法檢測時需要對其衍生化后才可進行，衍生化過程復雜且色譜峰容易出現異構化裂分，不適宜對糖醛酸和氨基糖的分析，適用范圍不廣泛。其中，HPLC 法具有良好的穩定性以及可供選擇的色譜柱類型較多，是單糖組成分析中應用最廣泛的技術之一。但糖類物質無紫外吸收基團，不能直接使用HPLC-UV 法進行定量分析，在對單糖進行衍生化后，可以采用HPLC-UV 法進行分析且具有較高的靈敏度[24]。玄光善等[25]采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-menthy-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生化HPLC 法，分析了樺褐孔菌Inonotus obliquus多糖的單糖組成，此法反應條件溫和，分析快速、穩定，比柱前衍生化氣相色譜法更為簡便[26?27]。

本研究以梨園塊菌Tuber liyuanum為實驗材料，采用水提醇沉法提取多糖，對提取工藝進行優化，并建立多糖的單糖組成分析檢測方法，為梨園塊菌多糖的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮樣品 2020 年7 月采購于云南省昆明市盤龍區雙龍鄉，經中國科學院昆明植物研究所劉建偉，進行分子鑒定為梨園塊菌Tuber liyuanum；單糖標準品D-葡萄糖（HPLC≥98%）、D-甘露糖（HPLC≥98%）、D-半乳糖（HPLC≥98%）、L-巖藻糖（HPLC≥98%） 北京索萊寶科技有限公司；D-無水葡萄糖、苯酚、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鉀 國藥集團化學試劑有限公司；濃硫酸 重慶川東化工（集團）有限公司；無水乙醇 天津市大茂化學試劑廠；三氟乙酸（TFA）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 上海麥克林生化科技有限公司；蒸餾水 實驗室自制；所有試劑均為分析純。

Agilent 1260 型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；BUCHI R-100 旋轉蒸發儀 瑞士步琦有限公司；SHB-Ⅲ S 循環水式多用真空泵 鄭州市亞榮儀器有限公司；3H16RI 智能高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；SCIENTZ-10N 冷凍干燥機寧波新芝生物科技股份有限公司；ME 104E 型萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理及多糖提取 將塊菌樣品洗凈后，在40 ℃條件下風干至恒重后，粉碎，加入適量無水乙醇在45 ℃水浴中攪拌浸提3 次，每次1 h，將浸泡過后的樣品粉末晾干后備用。

多糖提取工藝：稱取梨園塊菌樣品粉末，按比例加入蒸餾水進行加熱回流提取，提取結束后收集上清液并趁熱過濾，避免冷卻后影響溶液過濾的速度；將濾液濃縮至小體積后，加入多糖濃縮液1/3 體積的Sevage 試劑（V三氯甲烷:V正丁醇=4:1）進行震蕩、靜置和分液等一系列操作去除蛋白，然后將4 倍體積無水乙醇加入上清液中于4 ℃靜置過夜，促使多糖充分析出，使用離心方式收集沉淀并冷凍干燥得到梨園塊菌粗多糖。

1.2.2 多糖含量的測定 參照苯酚-硫酸法測定樣品的總糖含量[28]。

1.2.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制 精密稱取干燥的無水葡萄糖標準品0.1003 g 于100 mL 容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，配成濃度為1.003 mg/mL 的葡萄糖標準對照品溶液，備用。準確吸取葡萄糖標準對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 分別定容至50 mL 作稀釋液。取各稀釋液1.0 mL 于試管中，加蒸餾水和5%苯酚試液各1.0 mL，搖勻，迅速加入5.0 mL 濃硫酸，混勻后放置5 min 置于沸水浴中加熱20 min，冷卻至室溫在490 nm 波長處測定其吸光度值A，以蒸餾水代替葡萄糖溶液參與反應的體系作空白對照。以濃度x 為橫坐標、吸光度值A 為縱坐標，建立標準曲線回歸方程：A =7.7325x+0.0186，R2=0.9993；在0.02～0.12 mg/mL 之間線性關系良好。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 配成濃度是1.0 mg/mL的粗多糖溶液，準確吸取1.0 mL 于試管中，按照上述的方法測定供試品的吸光度值A，計算梨園塊菌的多糖得率。

多糖得率（%）＝（粗多糖質量×多糖含量/原料質量）×100

1.2.3 單因素實驗 針對多糖提取工藝的研究，其中影響多糖得率最主要的因素包括提取料液比、提取時間和提取溫度等，在本論文中分別選擇不同的因素條件進行多糖得率的單因素實驗考察。

1.2.3.1 提取料液比對多糖得率的影響 每次實驗固定提取溫度為90 ℃、提取時間為90 min，分別提取3 次，考察不同料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）條件下對多糖得率的影響。

1.2.3.2 提取時間對多糖得率的影響 固定料液比為1:20 g/mL、提取溫度為90 ℃，分別提取3 次，考察不同提取時間（30、60、90、120、150 min）條件下對多糖得率的影響。

1.2.3.3 提取溫度對多糖得率的影響 固定料液比為1:20 g/mL、提取時間為90 min，分別提取3 次，考察不同提取溫度（80、85、90、95、100 ℃）條件下對多糖得率的影響。

1.2.4 正交試驗設計 在上述單因素實驗的基礎上，采用L9（34）的正交試驗設計，試驗的因素與水平見表1。

表1 試驗的因素水平Table 1 Factor and level of the experiment

1.2.5 單糖組成測定 參照文獻[29?31]方法并稍作改進分析測定。

樣品制備：準確稱取2 mg 樣品于5 mL 安瓿瓶中，加入2 mol/L 三氟乙酸1 mL 氮氣封口后110 ℃水解4 h，蒸干，用甲醇洗滌后蒸干，反復3 次去除殘留的三氟乙酸，再加1 mL 蒸餾水溶解得2 mg/mL多糖水解液。取200 μL 水解液與200 μL 0.6 mol/L的NaOH 溶液，再加入0.5 mol/L 的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）甲醇溶液200 μL，混勻后在70 ℃水浴中反應30 min，冷卻至室溫加入0.6 mol/L 的HCl 溶液200 μL 以中和NaOH。然后再加入1 mL三氯甲烷，旋渦振蕩、離心，去三氯甲烷層，重復萃取3 次除去多余的PMP，水相用0.45 μm 微孔濾膜過濾，濾液稀釋2 倍用于HPLC 分析。

色譜條件：采用Agilent 1260 型高效液相色譜系統分析，Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6×150 mm，5 μm）；流速為1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；檢測波長為250 nm。流動相A 為0.02 mol/L 的KH2PO4緩沖液，流動相B 為乙腈，在0 min→10 min→30 min 內變化乙腈的比例為15%→20%→25%進行梯度洗脫。

1.3 數據處理

每組試驗平行重復3 次，用SPSS 17.0 軟件對試驗結果進行t-檢驗和LSD 多重比較分析，結果以均值±標準差（Mean±SD）表示，用Excel 2010 和Origin 軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對多糖得率的影響 由圖1 可知，當提取所用料液比在1:10～1:25 g/mL 之間，隨著料液比體積的增加，提取多糖的得率也隨之增高，且在料液比為1:25 g/mL 時，得率達到最大值9.17%；而后再提高料液比體積，多糖的得率并未提高，反而呈現出下降趨勢。在較低料液比體積提取下，由于提取溶劑較少，多糖沒有得到充分溶解，使得得率不高；此外，增加溶劑有助于提高多糖的溶出，但提高溶劑量會導致濃縮過程時間較長，可能會造成多糖的分解，從而影響多糖的得率[32]。因此，選擇料液比為1:25（g/mL）作為后續試驗優化的參數條件。

圖1 提取料液比對梨園塊菌多糖得率的影響Fig.1 The effect of solid-to-liquid ratio on the yield of polysaccharide from T.liyuanum

2.1.2 提取時間對多糖得率的影響 由圖2 可知，當提取時間在30～60 min 之間，隨著提取時間的延長，多糖的得率也隨之增高，提取時間在60 min 時，得率達到最大值8.04%；而后再延長提取時間，得率反而下降并趨于平穩。這可能是由于提取時間短，多糖提取不充分，導致得率低；提取時間長使多糖不斷溶出，與此同時在長時間的高溫加熱下容易造成多糖結構的破壞和分解，也可能存在因多糖分子內部沸騰引起擴散通道堵塞的情況，使多糖難以溶出導致得率降低[33?34]。因此，選擇提取時間為60 min 作為后續試驗優化的參數條件。

圖2 提取時間對梨園塊菌多糖得率的影響Fig.2 The effect of extraction time on the yield of polysaccharide from T.liyuanum

2.1.3 提取溫度對多糖得率的影響 由圖3 可知，隨著提取溫度的升高，多糖的得率也隨之提高，當提取溫度達到90 ℃時，多糖的得率最大，為7.48%；之后進一步升高提取溫度，得率出現下降。分析原因可能是在一定溫度范圍內隨著溫度升高，加快了分子間的運動，有助于水溶性多糖溶出[35]。但溫度超過范圍，會存在高溫加速破壞多糖分子結構的情況，進而導致多糖得率的降低[36]。因此，可選擇提取溫度為90 ℃作為后續試驗優化的參數條件。

圖3 提取溫度對梨園塊菌多糖得率的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide from T.liyuanum

2.2 多糖得率正交試驗設計結果與分析

根據正交試驗設計，考察料液比（g/mL）、提取時間（min）、提取溫度（℃）等因素的相互作用對梨園塊菌多糖得率的影響，進行試驗設計結果的極差分析（表2）和對因素水平間進行方差分析（表3），結果如下所示。

表2 梨園塊菌多糖提取的L9（34）正交試驗設計Table 2 L9(34) orthogonal design of polysaccharide extraction from T.liyuanum

表3 因素水平間梨園塊菌多糖得率的方差分析Table 3 Variance analysis of yield of polysaccharide from T.liyuanum

根據表2 和表3 的結果分析可知，在方差分析中因素A、B、C 之間對梨園塊菌多糖得率具有極顯著的差異影響（P＜0.01）。通過正交試驗設計的極差分析可得，在料液比、提取時間、提取溫度等因素之間相互作用中，對梨園塊菌多糖得率的影響程度次序按由大到小排列為：C（提取溫度）＞A（料液比）＞B（提取時間）。綜上所述，多糖提取的理論最佳工藝水平組合為A2B2C2，即料液比為1:25 g/mL、提取時間為60 min、提取溫度為90 ℃。

2.3 試驗驗證

采用上述正交試驗設計中所獲得的理論優水平組合，對梨園塊菌多糖提取試驗驗證，進行3 次重復試驗，測得多糖的平均得率為10.57%±0.31%。因此，該提取工藝條件具有較好的可行性，可供后續梨園塊菌多糖提取研究作參考。

2.4 單糖組成分析

2.4.1 標準單糖的衍生化分析 在本項研究工作開展之前，本研究團隊查閱了大量文獻資料發現在塊菌多糖研究中，主要是由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和少量的巖藻糖、阿拉伯糖等單糖組成。因此，在研究過程中經綜合考慮后選擇其中4 個標準單糖作為標準對照進行初步研究分析與探討。在這里，分別選擇了D-甘露糖、L-巖藻糖、D-葡萄糖和D-半乳糖等標準品并進行精確稱量，加水溶解配成濃度為1 mg/mL 的混標儲備液，再取混標儲備液稀釋2、4、8、16、32、64 倍配成梯度工作液進行PMP 衍生化處理和HPLC 分析。以各單糖組分的濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）建立標準曲線，結果見表4，根據信噪比計算檢測限（RSN=3）和定量限（RSN=10），回歸方程相關系數均為0.99 以上，表明各單糖衍生物濃度在3.906～250 μg/mL 之間線性關系較好。

表4 四種單糖組分的標準曲線、檢測限和定量限Table 4 Calibration curves,limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) for 4 different monosaccharides

2.4.2 梨園塊菌單糖組成測定結果 對工藝優化后提取的梨園塊菌多糖樣品進行單糖組成測定，經衍生化后進行HPLC 分析，結果與標準單糖色譜圖進行對比（圖4），判斷出多糖水解產物中單糖的種類。在色譜圖16.037 min 處出現一個無標準單糖對照的未知峰，由于在本項研究工作中只采用了4 種標準單糖進行對照分析與初步探討，可能存在標準單糖種類和數量選擇不合適的問題，對此處出現的未知峰猜測可能是其他類型的單糖，針對這個問題也進行了相關文獻的查閱，希望能夠根據已報道的相關同類文獻資料中出現的物質進行簡單比較分析；遺憾的是同類相關文獻僅查閱到有限的數量并且不能進行比較分析，無法推測該未知峰的單糖種類。因梨園塊菌單糖組成的分析研究工作報道較少，可供參考的文獻資料有限，本研究團隊將在后續的工作中圍繞這個未知峰進行探索分析和完善，以明確該未知峰的單糖種類。綜上，與4 種標準單糖對比分析后，可推斷出梨園塊菌多糖主要組成成分是D-葡萄糖，與少量的D-甘露糖、D-半乳糖等共同組成，其物質的量比為1:0.023:0.006。本實驗的結果與李美鳳等[37]的研究結果相似，在梨園塊菌多糖中的葡萄糖含量最高，占其多糖組成的90%以上，其余由少量的甘露糖和半乳糖共同組成，同時也說明了梨園塊菌多糖中的單糖組成分析檢測結果準確，這一結果也得到其他相關研究[38?39]的證實。

圖4 標準單糖（A）和梨園塊菌多糖衍生物（B）HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of standard monosaccharides (A)and T.liyuanum polysaccharides sample (B)

3 結論

采用水提醇沉方式提取梨園塊菌多糖，以單因素條件篩選和正交試驗相結合方式對其提取工藝進行優化，最終選擇結果良好的工藝參數并確定：提取溫度90 ℃、提取時間60 min 和料液比1:25 g/mL，通過驗證后在上述參數條件下，梨園塊菌的多糖得率達10.57%±0.31%；對所得多糖樣品進行單糖組成測定，經水解、PMP 衍生化試劑反應和HPLC 分析，結果顯示梨園塊菌多糖主要由D-葡萄糖以及少量的D-甘露糖、D-半乳糖等單糖組成，其物質的量比為1:0.023:0.006。以上結果可為梨園塊菌多糖開發利用奠定基礎。