模擬捕食者風險對大黃魚幼魚行為、游泳能力及應激水平的影響

王莉平 張 東 劉 鑫 林聽聽 劉聲宇 王孝杉 李思平

(1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心,上海 201306;2.中國水產科學研究院東海水產研究所,上海 200090)

在自然環境中,魚類經常需要改變其行為以應對變化的環境,來提高生存幾率[1],而捕食者是影響個體生存最強烈的環境因素之一[2—5]。魚類識別和躲避捕食者的能力不僅受遺傳因素影響,而且其行為特征還能通過環境發生改變[6—8]。研究表明,動物早期的生活環境可能會對其行為產生終身的影響[9],這取決于早期的經歷能否滿足個體后期的生存需求,如果遇到類似的情境,個體可以根據早期經驗,輕松應對[10,11]。Robin等[12]將三刺魚(Gasterosteus aculeatus)分別養殖在模擬捕食者環境、復雜環境和變化的社會環境中時,發現早期環境壓力能夠影響魚的行為表型。由于在沒有捕食壓力的人工養殖環境中魚類的行為可能無法得到充分的發育,因此,Brown等[13]指出,在養殖水體中利用抄網模擬捕食者對魚類進行追趕訓練,可以使人工養殖的魚獲得與野生個體相當的抗捕食者行為。Mirza 和Chivers[14]也證明了放流前進行適當的野化訓練能夠提高放流魚的成活率。

人工增殖放流已成為恢復魚類自然資源的重要手段,人工養殖魚放流效果不佳的狀況也日益受到重視,因此,放流前對魚苗進行馴化使其具備應對多種風險的能力已成為共識。抄網追趕訓練已被證實能夠改變一些魚類的行為特征,使其更好地應對復雜多變的外界環境,因而此類訓練已作為魚類放流前馴化的手段之一。此外,運動訓練對于提高魚類的游泳能力也有一定的作用[15,16]。研究已證實,抄網追趕訓練可綜合性地改善魚類的行為特征及運動表現,是一種高效并且容易操作的馴化方式[17]。然而,抄網追趕對魚類來說也是一種脅迫,脅迫對魚類造成的影響可能是直接致死的,也可能是亞致死的。亞致死強度的脅迫會使魚類產生應激反應[18],長期處于應激狀態,會對魚類的生長、抗病力等產生負面影響[19—22]。因此,不合理的訓練設置可能導致魚體生長受損、免疫能力和生存能力下降等[23,24]。

大黃魚(Larimichthys croceaRichardson,1846),隸屬于鱸形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、黃魚亞科(Larimichthysinae)、黃魚屬(Larimichthys),為我國傳統“四大海產”之一,是我國福建和浙江等省重要的海洋經濟魚類之一。由于20世紀60、70年代的過度捕撈,導致其資源急劇衰退。盡管自1987年以來每年都會通過增殖放流對野外資源進行補充,然而收效并不理想[25]。主要原因可能是放流魚苗沒有獲取足夠的野外生存經驗,存在著一些行為特征以及運動能力上的缺陷,使得成活率較低,這也是目前魚類增殖放流中普遍存在的問題[26—28]。雖然抄網追趕模擬捕食者風險是一種高效并且容易操作的馴化方式,但由于不同魚類對脅迫的敏感程度不同[29],因而針對不同種,操作方式也不同。大黃魚對于機械操作脅迫的反應較為敏感且強烈,不管是幼魚還是成魚只要受到異常擾動,就會慌亂不安,嚴重時甚至會死亡[30],因此亟需對抄網追趕設置進行深入研究。本研究以80 dpf (Days post fertilization)的大黃魚幼魚為研究對象,探究了大黃魚幼魚在不同水平的追趕刺激下其生長、行為、游泳能力及應激水平的變化,以確定合理的刺激水平,旨在為后續研究大黃魚的行為及對大黃魚放流前的馴化奠定基礎,同時本研究可為深入了解不同生態類型魚類受到此類刺激后的反應機制提供更多案例。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

實驗中所使用的大黃魚魚苗由中國水產科學研究院東海水產研究所福建福鼎研究中心自行孵育,魚卵購自于福建省福鼎市沙埕鎮大白鷺村閩海農業專業合作社。將魚卵放入孵化桶中,20h左右即孵化出仔魚,孵化水溫為23℃,鹽度為18.2,孵化后第3天開始投喂輪蟲,第8天開始投喂豐年蟲,第12天開始投喂橈足類,第19天開始投喂配合飼料。暫養及實驗期間均投喂沉性顆粒飼料,每日投喂3次,分別在8:00—9:00、12:00—13:00和18:00—19:00進行,每天下午5:00—6:00排污換水,養殖期間水溫為（20.43±1.55）℃,鹽度為18.2,光照為1000 lx。

1.2 實驗設計

將80日齡(dpf)的大黃魚幼魚[體長:(3.71±0.48) cm,體重:(1.27±0.42) g]隨機分配到12個圓柱形養殖桶(直徑×高=80 cm×80 cm),每桶100尾,暫養1周。實驗設置抄網刺激對照組和處理組[2.5、5.0和7.5min/(F·D)][minute/(Frequency·Day),(分鐘/次·天)],每天分別進行2次處理,每組3個重復,各養殖桶隨機編號。

抄網刺激前,將所有養殖桶同時停氣,并排水至30 cm深,用手抄網(直徑:30 cm,網長:15 cm,網孔直徑:2 mm,顏色:黑色,柄長:1 m)環繞桶周,速度為6 s/r,追逐魚群,分別在每天上午9:00—11:00,下午14:00—17:00各進行1次抄網追趕訓練,各組刺激時間分別為0、2.5min、5.0min和7.5min。在刺激過程中保證每條魚都受到追趕,并避免網掛到魚,對魚造成損傷。且每日喂食前后至少超過1h再進行抄網追趕,避免刺激對魚的攝食及消化造成影響。每日記錄各養殖桶的死魚數及魚苗的游動情況,刺激結束后同時開氣、加水,所有使用的工具前期均使用次氯酸鈉消毒。刺激15d后,各桶隨機撈出20尾暫養于另一養殖桶中進行后續分析,剩余幼魚繼續進行抄網追趕刺激,直至30d。在30d處理結束后,將魚暫養7d,進行二次抄網追趕,追趕時間為10min(刺激強度同上),測試前期抄網追趕對大黃魚幼魚后期壓力應對的影響。

1.3 取樣及測定

分別對刺激15d和30d的大黃魚幼魚進行采樣。采樣時,使用丁香酚將停止刺激并暫養3d后的幼魚麻醉,稱量體長體重,并采集血樣。同時,為探究不同水平的抄網追趕對大黃魚幼魚行為的影響,實驗對停止刺激3d后的大黃魚幼魚分別進行行為測試,包括新環境測試、恢復性測試、壓力應對方式測試和回避測試,還進行了游泳能力測試。此外,所有實驗魚在行為測試以及采樣前均禁食24h。同上,二次刺激結束后立即麻醉取血樣。

1.4 行為測試方法

所有行為測試均在長×寬×高=70 cm×35 cm×30 cm的玻璃缸中進行,測試水溫及光照強度均與養殖環境相同。玻璃缸的底部及四周用白色防水紙粘貼,避免人為因素的干擾。底部平均劃分成50個正方形小格(7 cm×7 cm),并進行分區:玻璃缸四個角的正方形小格代表角區域,距離缸壁一個正方形小格去除角區域部分為邊區域,除去邊角區域剩下的為中間區域。在玻璃缸頂端架一臺攝像頭(螢石云),全程拍攝記錄,實驗魚都未被重復測試。

新環境測試(Novel environment test) 為了測試抄網追趕訓練能否提高大黃魚幼魚對陌生環境的探索性,實驗對不同水平抄網追趕下的大黃魚幼魚進行了新環境測試(圖 1)。將距離玻璃缸一端14 cm處放置一塊白色雪弗板,隔出35 cm×14 cm×30 cm的區域作為適應區。測試開始前,使用100 mL燒杯將魚輕輕撈出,帶水轉移至玻璃缸的適應區適應30min,隨后輕輕提起隔板,使魚自由游出,共記錄10min[31,32]。記錄的指標包括變換區域的次數、進入邊區域的次數、進入角區域的次數、出適應區的次數、在邊區域待的總時間(s)、在角區域待的總時間(s)和在角區域單次持續的最長時間(s)。

圖1 新環境測試裝置Fig.1 Schematic diagrams of the experimental procedures for the novel environment test

恢復性測試(Emergence test)為了測試抄網追趕訓練能否影響大黃魚幼魚脅迫恢復后的運動活躍能力,實驗對不同水平抄網追趕下的大黃魚幼魚進行了恢復性測試(圖 3)。按照壓力應對測試相同的方法先將魚在小抄網上于空氣中暴露60s,放入適應區恢復6min,隨后輕輕抬起隔板至水面的2/3處,觀察10min[13,17]。記錄的指標包括:首次出適應區的時間、首次回適應區的時間(s)和在適應區外待的時間(s)。

圖3 恢復性測試裝置Fig.3 Schematic diagrams of the experimental procedures for the emergence test

壓力應對方式測試(Stress coping style test)為了測試抄網追趕訓練能否改善大黃魚幼魚對脅迫的應激恢復能力,實驗對不同水平抄網追趕下的大黃魚幼魚進行了缺氧應激測試(圖 2)。將單尾魚轉移至手抄網(直徑15 cm)于空氣中暴露3min,隨后將魚輕輕放入水中,直至恢復穩定,判定標準為魚能夠正立身體、無傾斜、不亂竄、正常緩慢游動。記錄指標:魚恢復正常游動所需要的時間(s)[33]。

圖2 壓力應對方式測試裝置Fig.2 Schematic diagrams of the experimental procedures for the stress coping style test

回避測試(Avoidance test)為了測試抄網追趕訓練能否提高大黃魚幼魚逃避追捕的能力,本實驗對不同水平抄網追趕下的大黃魚幼魚進行了回避測試(圖 4)。回避測試在恢復性測試后進行,恢復性測試完成20min后,當魚出現在魚缸對面時,用一個和抄網追趕刺激中顏色、大小不同的手抄網(直徑:10 cm,柄長:25 cm),給予其一個新的信號刺激,迅速捕撈魚,并停留15s,15s內魚逃回適應區則認為魚有回避行為,比較各組魚的回避情況[17]。

圖4 回避測試裝置Fig.4 Schematic diagrams of the experimental procedures for the avoidance test

1.5 游泳速度測定方法

為了探究抄網追趕訓練對大黃魚幼魚游泳能力的影響,實驗對不同水平抄網追趕下大黃魚幼魚的絕對臨界游泳速度(Absolutely critical swimming speed,Ucrita)和相對臨界游泳速度(Relatively critical swimming speed,Ucritr)進行了測定。設備購于丹麥Loligo Systems公司,實驗中臨界游泳速度的測定采用Brett流速遞增法[34,35],測定方法參照王曉等[36]在探究溫度梯度對四大家魚臨界游泳速度的影響中的操作。正式實驗開始之前需要預先評估實驗魚的絕對臨界游泳速度(Ue),操作方法為先將魚用容器轉移至泳道中,在低流速(5 cm/s)下適應15min,隨后每2min增加0.4 BL/s (BL=Body length=體長)的速度,直至魚力竭。表現為無游泳狀態,貼在后方鋼絲網上持續超過20s,此時的流速即為Ue,從而確定正式實驗時絕對臨界游泳速度實際值的增量ΔU(15%Ue)。

正式實驗時,同樣將魚先在低流速(5 cm/s)下適應15min,隨后每5min增加0.5 BL/s至60%Ue,之后每15min增加15%Ue,直至魚疲勞力竭,貼在后方鋼絲網上持續超過20s。此時的流速即為設定時間段的最大游泳速度(Umax)。

計算公式如下:

1.6 應激水平測定方法

為探究抄網追趕訓練對大黃魚幼魚應激水平的影響,同時探究停訓后大黃魚幼魚再次面對追趕脅迫時的應激水平,本實驗采用南京建成生物研究所生產的試劑盒對大黃魚幼魚血漿中皮質醇水平進行測定。測定原理是酶聯免疫吸附法(ELISA),按照試劑盒的說明書進行操作,在酶標儀450 nm波長下測定各孔的吸光度。根據濃度和吸光度算出標準曲線的回歸方程,使用ELISA Calc軟件選用logistic 四參數進行曲線擬合,然后代入標準曲線計算皮質醇濃度。

1.7 數據處理

為了避免觀察者不同所導致的系統誤差,本實驗行為學數據均由同一人進行采集和分析[37]。所有實驗數據均使用IBM SPSS Statistics 26和JASP16.1軟件進行統計分析。數據先使用Shapiro-Wilk法進行正態性檢驗,如果不符合正態分布,使用blom法進行轉換,之后使用單因素方差分析(Analysis of Variance,ANOVA)進行檢驗,如果ANOVA結果顯著,將用Tukey(T)法進行多重比較。為了彌補顯著性檢驗的不足,對效應量(η2)和貝葉斯因子(BF10)也進行了分析。低、中和高效應對應的η2分別為0.010、0.059和0.138,評價標準為小效應(0.010≤η2＜0.059)、中等效應(0.059≤η2＜0.138)和大效應(η2≥0.138)[38]。使用JASP16.1軟件進行貝葉斯統計分析,貝葉斯因子(BF10)決策標準參考Jefferys(1961)[39]。由于樣本量較少,回避測試結果采用Fisher’s exact test進行分析。本研究的零假設(H0)為抄網刺激對大黃魚幼魚的各項指標無顯著影響,對應的備擇假設(H1)為有顯著影響。

2 結果

2.1 模擬捕食者風險對大黃魚幼魚生長的影響

實驗開始時及處理15d和30d后實驗魚的體長和體重結果見表 1,數據均符合正態分布和方差齊性。結果表明不同強度抄網刺激未對體長及體重造成顯著影響(P＞0.05;表 2)。每天記錄各處理是否有死亡,實驗結束后比較各組魚的死亡率,結果表明各組死亡率之間無顯著差異(P＞0.05),各處理組魚的生長發育及健康狀況良好。顯著性檢驗接受H0;效應量表明15d刺激效應較弱,貝葉斯因子以中等程度的證據支持H0;效應量表明30d的刺激效應中等,貝葉斯因子表明支持H0的證據較弱。

表1 模擬捕食者風險對大黃魚幼魚生長的影響(平均值±標準差)Tab.1 Body length and wet body weight of the large yellow croaker at different treatments (mean±SD)

表2 生長相關數據分析結果Tab.2 Growth-related data analysis results

2.2 模擬捕食者風險對大黃魚幼魚行為的影響

新環境測試結果列于表 3。刺激15d后(圖 5A和5B),各刺激水平下的大黃魚幼魚在變換區域次數(A)、進入邊區域的次數(B)、進入角區域的次數(C)、出適應區的次數(D)、在邊區域待的時間(E)均無顯著差異(P值均大于0.05;具體見表 3)。角區域待的時間(F),顯著性檢驗(P=0.008)接受H1,多重比較結果顯示:5.0min/(F·D)組顯著(P＜0.05)高于7.5min/(F·D)組,其他各組之間差異不顯著(P＞0.05);貝葉斯因子(BF10=6.451)以中等程度的證據支持H1;效應量(η2=0.276)表明不同刺激強度對大黃魚幼魚在角區域所待時間的影響較大。在角區域單次持續的最長時間(G),顯著性檢驗(P＞0.05)接受H0,但效應量(η2=0.168)較大,貝葉斯因子(BF10=1.067)以較弱的證據支持H1。

圖5 第15天新環境測試行為參數Fig.5 The behavioral parameters of the large yellow croaker in the novel environment test after15-day chase treatment

表3 新環境測試相關數據分析結果Tab.3 Novel environment test related data analysis results

刺激30d后(圖 6A和6B),關于變換區域的次數(A),顯著性檢驗(P=0.017)接受H1,多重比較結果顯示:7.5min/(F·D)組顯著(P＜0.05)高于2.5min/(F·D)組;貝葉斯因子(BF10=3.656)以中等程度的證據支持H1;效應量(η2=0.244)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚變換區域次數的影響較大。進入邊區域的次數(B),顯著性檢驗(P=0.017)接受H1,多重比較結果顯示:7.5min/(F·D)組顯著(P＜0.05)高于2.5min/(F·D)組;貝葉斯因子(BF10=3.695)以中等程度的證據支持H1;效應量(η2=0.245)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚進入邊區域次數的影響較大。進入角區域的次數(C),顯著性檢驗(P=0.009)接受H1,多重比較結果顯示7.5min/(F·D)組顯著(P＜0.05)高于2.5min/(F·D)組;貝葉斯因子(BF10=6.146)以中等程度的證據支持H1;效應量(η2=0.273)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚進入角區域的次數影響較大。在角區域待的時間(F),顯著性檢驗(P=0.023)接受H1,多重比較結果顯示:7.5min/(F·D)組顯著(P＜0.05)高于2.5min/(F·D)組;貝葉斯因子(BF10=2.897)以較弱的證據支持H1;效應量(η2=0.231)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚在角區域待的時間影響較大。另外,出適應區的次數(D),在角區域單次持續的最長時間(G),顯著性檢驗(P＞0.05)接受H0;貝葉斯因子(BF10=0.399、0.359)以較弱的證據支持H0,效應量(η2=0.096、0.088)中等。在邊區域待的時間(E),顯著性檢驗(P＞0.05)接受H0;貝葉斯因子(BF10=1.244)以較弱的證據支持H1;效應量(η2=0.178)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚在邊區域待的時間影響較大。

圖6 第30天新環境測試行為參數Fig.6 The behavioral parameters of the large yellow croaker in the novel environment test after 30-day chase treatment

恢復性測試結果列于表 4。刺激15d后(圖 7A),各個刺激水平下的大黃魚幼魚首次出適應區的時間(A),顯著性檢驗(P＞0.05)接受H0;貝葉斯因子(BF10=4.114)以較弱的證據支持H0;效應量(η2=0.250)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚首次出適應區的時間影響較大。在適應區外待的時間(B),顯著性檢驗P＞0.05)接受H0;貝葉斯因子(BF10=0.295)以中等程度的證據支持H0;效應量(η2=0.070)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚在適應區外待的時間影響中等。首次回適應區的時間(C),顯著性檢驗(P=0.015)接受H1,多重比較的結果顯示5.0min/(F·D)組，首次回適應區的時間顯著(P＜0.05)長于對照組;貝葉斯因子(BF10=4.114)以中等程度的證據支持H1;效應量(η2=0.147)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚首次回適應區的時間影響較大。

表4 恢復性測試相關數據分析結果Tab.4 Emergence test related data analysis results

追趕刺激30d后(圖 7B),首次回適應區的時間(A)顯著性檢驗(P＞0.05)接受H0;貝葉斯因子(BF10=0.970)以非常弱的證據支持H0;效應量(η2=0.148)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚首次出適應區的時間影響較大。在適應區外待的時間(B),顯著性檢驗(P＞0.05)接受H0;貝葉斯因子(BF10=0.513)以較弱的證據支持H0;效應量(η2=0.110)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚在適應區外待的時間影響中等。首次出適應區的時間(C),顯著性檢驗(P＞0.05)接受H0;貝葉斯因子(BF10=0.258)以中等程度的證據支持H0;效應量(η2=0.059)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚首次出適應區的時間影響中等。

圖7 刺激15d（A）和30d（B）恢復性測試行為參數Fig.7 The behavioral parameters of the large yellow croaker in the emergence test after 15-day (A) and 30-day (B) chase treatment

壓力應對方式測試結果列于表 5。刺激15d后(圖 8),各個刺激強度下的大黃魚幼魚在壓力后的恢復時間上不存在顯著差異,顯著性檢驗(P＞0.05)接受H0;貝葉斯因子(BF10=0.224)以中等程度的證據支持H0;效應量(η2=0.049)較小,表明不同刺激水平對大黃魚幼魚壓力后恢復時間影響不大。刺激30d后(圖 8),各個刺激水平下的壓力后恢復時間顯著性檢驗(P＞0.05)接受H0;貝葉斯因子(BF10=0.378)以較弱的證據支持H0;效應量(η2=0.098)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚壓力后恢復時間影響中等。

圖8 刺激壓力應對方式測試行為參數Fig.8 The behavioral parameters of the large yellow croaker in the emergence test after chase treatment

表5 壓力應對方式相關數據分析結果Tab.5 Stress coping style test related data analysis results

回避測試結果表明,刺激15d和30d,各個刺激水平下的大黃魚幼魚回避率的統計學差異不顯著(P＞0.05;圖 9)。

圖9 刺激回避測試行為參數Fig.9 The behavioral parameters of the large yellow croaker in the avoidance test after chase treatment

2.3 模擬捕食者風險對大黃魚幼魚游泳能力的影響

隨機選取各處理組樣本進行游泳能力測試,數據分析結果列于表 6。刺激15d后,關于Ucrita(圖 10),顯著性檢驗(P=0.007)接受H1,多重比較結果顯示:5.0和7.5min/(F·D)組的Ucrita顯著低于(P＜0.05)處理組及2.5min/(F·D)組,其他各組之間差異不顯著(P＞0.05);貝葉斯因子(BF10=8.083)以中等程度的證據支持 H1;效應量(η2=0.651)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚Ucrita的影響很大。各組的Ucritr(圖 10)顯著性檢驗(P＞0.05)接受H0;貝葉斯因子(BF10=1.057)以較弱的證據支持H1;效應量(η2=0.377)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚Ucritr的影響較大。

圖10 刺激15d后所測得的絕對和相對臨界游泳速度Fig.10 The absolute and relative critical swimming speed of the large yellow croaker after 15-day chase treatment

表6 游泳能力相關數據分析結果Tab.6 Swimming ability related data analysis results

刺激30 d后,不同刺激水平下的Ucrita差異不顯著(圖 11),顯著性檢驗(P＞0.05)接受H0;貝葉斯因子(BF10=1.217)以較弱的證據支持H1;效應量(η2=0.447)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚Ucrita的影響較大。不同刺激水平下的Ucritr(圖 11),顯著性檢驗(P＞0.05)接受H0;貝葉斯因子(BF10=0.907)以較弱的證據支持H0;效應量(η2=0.380)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚Ucritr的影響較大。

圖11 刺激30d后所測得的絕對和相對臨界游泳速度Fig.11 The absolute and relative critical swimming speed of the large yellow croaker after 30-day chase treatment

2.4 模擬捕食者風險對大黃魚幼魚應激水平的影響

皮質醇數據分析結果列于表 7。刺激15d后(圖 12),皮質醇水平顯著性檢驗(P=0.049)接受H1,多重比較結果顯示:7.5min/(F·D)組的大黃魚幼魚皮質醇濃度顯著(P＜0.05)低于其他組;貝葉斯因子(BF10=2.101)以較弱的證據支持H1;效應量(η2=0.606)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚皮質醇水平的影響很大。

表7 皮質醇水平數據分析結果Tab.7 Cortisol concentration data analysis results

刺激30d后(圖 12),皮質醇水平顯著性檢驗(P=0.028)接受H1,多重比較結果顯示:2.5min/(F·D)組的皮質醇水平顯著(P＜0.05)低于其他組;貝葉斯因子(BF10=3.018)以中等程度的證據支持H1;效應量(η2=0.661)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚皮質醇水平的影響很大。

圖12 刺激15d和30d后各組皮質醇濃度Fig.12 The cortisol concentration of the large yellow croaker after15-day and 30-day chase treatment

2.5 早期模擬捕食者風險對大黃魚幼魚后期應激水平的影響

停止刺激后第8天,再次給予刺激,皮質醇水平分析結果列于表 8。顯著性檢驗接受H1(P=0.0004),多重比較結果顯示各處理組皮質醇水平均顯著低于對照組(圖 13),除5.0和7.5min/(F·D)組之間差異不顯著外,其余各組之間均存在顯著差異;貝葉斯因子(BF10=59.843)以非常強的證據支持H1;效應量(η2=0.968)表明不同刺激水平對大黃魚幼魚二次應激反應的影響非常大。

圖13 再次刺激后皮質醇濃度Fig.13 The cortisol concentration of the large yellow croaker stimulated again at a 7-day interval after terminating the 30-day stimulation

表8 二次刺激后皮質醇數據分析結果Tab.8 The cortisol concentration data analysis results of second stimulation

3 討論

抄網追趕能夠模擬捕食者風險,常用于增殖放流野化訓練。大黃魚是我國增殖放流的重要目標物種[1],現如今并未取得可觀成效,主要原因可能是人工養殖的放流苗種在一些行為特征及運動能力上存在缺陷,使其成活率較低[26—28]。本實驗通過不同水平抄網追趕模擬捕食者風險發現,大黃魚幼魚行為、游泳能力及應激反應均受到一定的影響。特別是停訓后第8天再次接受刺激時,大黃魚幼魚的應激水平顯著提高,為后續探究大黃魚的行為以及放流前的馴化奠定了行為學研究的基礎。

3.1 抄網追趕模擬捕食者風險對大黃魚幼魚生長的影響

有研究表明,養殖期間的一些脅迫會使魚類產生應激反應,進而影響生長。例如,付成等[40]研究發現短期捕食脅迫會降低鯉(Cyprinus carpio)幼魚的生長率;翁朝紅等[41]研究發現操作脅迫會抑制大黃魚幼魚的生長。本研究發現(表 1),雖然顯著性檢驗顯示15d的抄網追趕訓練未對大黃魚幼魚的體重及體長產生顯著負面影響,但貝葉斯因子和效應量都顯示30d刺激訓練的影響已不容忽視。本研究的結果不甚顯著,可能是刺激強度不夠所致,也或者處于溫和應激狀態下的魚,經歷一段時間追趕刺激后,自身能夠對外源刺激做出適應性調整[17]。雖然總體影響不顯著,但有意思的是2.5min/(F·D)組的魚生長最慢,7.5min/(F·D)組的魚生長最快,這是否意味著大黃魚對應激的適應力強,值得進一步研究。

3.2 抄網追趕模擬捕食者風險對大黃魚幼魚行為的影響

在自然環境中,魚類經常面臨著被捕食的風險,尤其是在幼魚階段,捕食脅迫常常會導致魚類的大量死亡[42]。同樣,捕食脅迫也是放流魚進入野外環境后所面臨的主要生存威脅之一,在眾多影響放流魚存活率的因素中,攝食-反捕食能力不足被認為是直接導致死亡率高的重要因素[27,44]。Brown等[13]指出持續的抄網追趕訓練能夠提高來自高捕食或者低捕食壓力地區埃氏短棒鳉(Brachyrhaphis episcopi)后代的大膽性。Moscicki 等[45]也證明了網追趕處理能夠增強黑帶嬌麗魚(Amatitlania nigrofasciata)的大膽性,并誘導提高魚的應激恢復能力。

經歷了15d的追趕訓練后(圖 5),變換區域次數(A)、進入邊區域的次數(B)、進入角區域的次數(C)、出適應區的次數(D)、在邊區域待的時間(E)的數據分析結果支持H0，在角區域待的時間(F)接受H1；在角區域單次持續的最長時間(G)，顯著性檢驗接受H0，但效應量較大，從效應量角度考慮，抄網追趕訓練能夠在一定程度上影響大黃魚幼魚在角區域待的時間，整體水平上，5min/(F.D)組在角區域待的時間最長。綜合分析，抄網追趕訓練并沒有對大黃魚幼魚對陌生環境探索性產生較大影響。追趕刺激30d(圖 6)后的結果,可看出一定強度的刺激訓練可以降低大黃魚的冒險性。7.5min/(F·D)組的大黃魚幼魚在變換區域的次數、進入邊區域的次數、進入角區域的次數都要顯著高于2.5min/(F·D)。

恢復性測試中,追趕訓練15d后(圖 7A),顯著性檢驗及效應量均以較強的證據支持抄網追趕模擬捕食者風險會對大黃魚幼魚首次回適應區的時間產生顯著消極影響的結論。顯著性檢驗顯示首次出適應區的時間接受H0,但效應量較大,從效應量的角度分析,抄網追趕模擬捕食者風險會對大黃魚幼魚首次出適應區的時間產生較大影響。追趕訓練30d后(圖 7B),各刺激強度間無顯著差異,可能與魚已適應了刺激有關。該實驗結果也從另一方面佐證了經過抄網刺激訓練后的大黃魚更加謹慎。

壓力應對測試中,追趕訓練15d或30d后(圖 8),不管是顯著性檢驗,還是效應量和貝葉斯因子,都顯示各組之間的壓力耐受水平無顯著差異,唯一異常點是30d刺激后,5.0min/(F·D)組的壓力耐受水平(和恢復時間成反比)反而降低了(圖 8),可能是個體差異所致,30d刺激后的數據的標準差明顯高。魚對壓力的耐受水平應該和受刺激魚運動強度對魚的呼吸(Excess post exercise oxygen consumption,EPOC,過量耗氧)能力影響有關。例如,力竭追趕訓練對巖原鯉(Procypris rabaudi)幼魚的 EPOC無顯著性影響,但卻顯著提高了中華倒刺鲃(Spinibar-bus sinensis)幼魚的EPOC和運動后恢復時間[45];持續4周的有氧運動訓練使虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的心臟搏動能力和心輸出量顯著提高[46];以1.5 BL/s的速度訓練8個月,能使大鱗大馬哈魚(Oncorhynchus tshawytscha)的靜止耗氧率提高50%[47]。本研究在刺激30d后,除了5.0min/(F·D)組略高于對照組外,2.5組和7.5min/(F·D)組的刺激后恢復時間均要低于對照組,這說明隨著追趕訓練的持續,大黃魚幼魚的有氧呼吸能力得到了鍛煉,進而提高了其低氧耐受水平。回避性測試中,不管是15d還是30d (圖 9)的追趕訓練,都對其回避率無顯著影響,說明該訓練方式可能對大黃魚幼魚回避危險的能力影響不大。

3.3 抄網追趕模擬捕食者風險對大黃魚幼魚游泳速度的影響

游泳能力關乎魚類的生存、避敵、捕食、棲息地的選擇等[48—51]。因此,魚類的游泳能力決定著其對自然環境的適應能力[50—53]。研究表明,追趕訓練能夠在一定程度上塑造魚類的游泳能力,而臨界游泳速度(Critical swimming speed,Ucrit)是評定魚類游泳能力強弱極為重要的指標[36,53]。

本研究中,刺激15d后(圖 10),顯著性檢驗和效應量都以較強的證據支持H1,5.0和7.5min/(F·D)組大黃魚幼魚的Ucrita顯著低于對照組,2.5min/(F·D)組顯著高于7.5min/(F·D),雖然顯著性檢驗顯示各組的Ucritr不存在顯著差異,但效應量較大,從效應量的角度來講,抄網追趕模擬捕食者風險會對大黃魚幼魚的Ucritr產生較大影響。另外,Ucrita和Ucritr與刺激強度呈負相關性,這說明隨著刺激強度的增大,大黃魚幼魚的Ucrit反而降低了,這與周龍艷等[54]對胭脂魚進行的追趕訓練得到的游泳速度結果一致?？赡苁谴簏S魚生性敏感,應激反應強烈,從而導致應激反應所產生的負面影響抵消了追趕訓練對Ucrit的正面效應。

刺激30d后(圖 11),P表明各組的Ucrita和Ucritr均無顯著差異,但從效應量角度來講,抄網追趕模擬捕食者風險會對大黃魚幼魚的Ucrita和Ucritr產生較大影響。趨勢上,除了2.5min/(F·D)組的Ucrita和Ucritr略低于對照組外,5.0和7.5min/(F·D)組的均高于對照組,并且5.0min/(F·D)組的Ucrita和Ucritr分別要比對照組高約52%和39%,7.5min/(F·D)組的Ucrita和Ucritr分別要比對照組高約13%和20%。類似的訓練結果在前人的研究中已有出現,Farrel等[55]對虹鱒(Oncorhynchus mykiss)進行了為期28—52d的運動訓練,發現經過運動訓練的魚游泳速度要比那些沒有經過訓練的魚快12%。Li 等[56]以瀕危魚類厚頜魴(Megalobrama pellegrini)為研究對象,每天進行一次為期5min的抄網追趕訓練,持續5周,最終的游泳測試結果表明雖然力竭性追趕訓練組和對照組魚的游泳速度不存在顯著差異,但力竭訓練組的Ucrit值要比對照組高5%。本實驗中,在進行15d的追趕訓練后,訓練組的Ucrit低于對照組,而在30d后,和對照組相比,Ucrit得到了不同程度的改善,說明15d的訓練時間還沒有達到提高大黃魚幼魚Ucrit的程度。追趕訓練效果也因種而已,例如Liu等[57]對瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)僅進行了為期14d的追趕訓練,訓練組魚的Ucrit就顯著高于對照組。這說明不同魚的游泳能力可塑性也不同,要依具體的研究對象確定訓練時間。

3.4 抄網追趕模擬捕食者風險對大黃魚幼魚應激水平的影響

在環境脅迫導致的應激狀態下,魚體血液指標會發生一系列變化,其中血液皮質醇水平的升高是魚類應激反應的主要特征,通常用來評估應激反應的強度[58,18]。過多的皮質醇會造成生長停止,肌肉消退及脂肪合成減少,機體消瘦[60]。有研究表明,動物幼體長期暴露在高捕食壓力下通常會導致更加積極的應對方式,表現為皮質醇水平的降低。Fischer 等[61]分別比較了來自高捕食壓力和低捕食壓力地區孔雀魚(Poecilia reticulata)的皮質醇含量,表明高捕食壓力地區的孔雀魚皮質醇含量顯著低于低捕食壓力地區。但也有研究發現了相反的結果,例如Hope等[9]對黑帶嬌麗魚(A.nigrofasciata)的追趕刺激實驗中發現刺激組皮質醇水平要顯著高于非處理組。在本研究中,刺激15d后(圖 12),顯著性檢驗以及效應量都以較強的證據支持H1,多重比較結果顯示7.5min/(F·D)組的大黃魚幼魚皮質醇水平顯著低于對照組及其他處理組,2.5和5.0min/(F·D)組和對照組無顯著差異。刺激30d后(圖 12),顯著性檢驗以及效應量也都以較強的證據支持H1,多重比較結果顯示2.5min/(F·D)組的大黃魚幼魚皮質醇水平顯著低于對照組及其他處理組,5.0和7.5min/(F·D)組和對照組無顯著差異。這說明在短期內,大黃魚幼魚對較強刺激適應能力強,而一旦適應后,長期的低水平刺激反而有利于降低皮質醇水平。出現這種現象的原因可能是在短期內,較高水平的刺激實際上是增加了大黃魚幼魚的訓練時間,從而更早達到降低其應激水平的目的。而刺激30d后,較低水平的刺激也達到了能夠降低其應激水平的目的,但較高水平的刺激可能略微超過了實驗魚的承受范圍,反而使其皮質醇水平又恢復到了和對照組相近的水平,此現象有待未來進一步研究。

3.5 早期抄網追趕模擬捕食者風險對大黃魚幼魚后期應激水平的影響

目前經濟水生生物的放流方式主要有海面直接放流和船載滑道放流。由于放流個體的游泳能力及規避風險能力較差,在放流過程中受到水面沖擊、水流及捕食者等因素的影響[61],及放流過程中的運輸、碰撞等物理刺激和進入一個完全陌生的環境中的不適應性[62,63]會使放流魚產生一定的應激反應,這種應激反應進而會影響放流魚的存活率,降低增殖放流的效果。在本實驗中,當30d刺激結束后的第8天對大黃魚幼魚進行再次刺激時(圖 13),顯著性檢驗、效應量以及貝葉斯因子都以極強的證據支持H1,這說明網追趕個體對壓力具有較高的容忍度,對于提高放流大黃魚的適應性來說具有十分重要的意義。Takahashi 等[17]以真鯛(Pagrus major)幼魚為研究對象探究了抄網追趕對其攝食行為的影響。結果表明,投喂飼料90min后,來自抄網追趕組的真鯛幼魚攝取飼料的數量更多,進行攝食的魚的數量也更多,這說明每天受到輕微壓力脅迫的魚類對環境變化引起的壓力更具有抵抗力。此外,Archard等[64]也揭示了輕微的壓力脅迫(轉移到新環境)后暴露在高捕食者壓力的埃氏短棒鳉(B.episcopi)要比來自低捕食者壓力的魚應激激素(皮質醇)的釋放率低,和本研究的結果一致。說明用來模擬捕食者風險的抄網追趕訓練能夠降低大黃魚幼魚再次面對風險時的應激水平,這對于其快速適應放流后的自然環境來說具有重要意義。

綜上所述,本研究進一步證明了模擬捕食者風險訓練能夠在一定程度上提高大黃魚幼魚對陌生環境的適應能力,同時在改善個體的游泳能力方面也發揮了一定的作用。此外,這種訓練方式能夠顯著降低個體再次面對壓力時的應激水平,對于提高增殖放流個體的適應性來說具有極為重要的意義。