肉桂揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合工藝優(yōu)選及特征鑒別

陳海清，李后如，謝俊俊

1.江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330001；2.江西銀濤藥業(yè)有限公司，江西 撫州 344100

右歸膠囊處方中有多種含揮發(fā)油成分的中藥材，其中肉桂中的揮發(fā)油成分具有明顯藥理作用。但肉桂揮發(fā)油性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光、熱等容易氧化分解，且有較強(qiáng)揮發(fā)性［1］，為保證揮發(fā)油穩(wěn)定和相應(yīng)制劑的療效，實(shí)際生產(chǎn)中多采用β-環(huán)糊精（β-CD）包合使其固化，最大限度地保留揮發(fā)油成分［2］。本研究通過正交試驗(yàn)優(yōu)選出最佳包合工藝條件，并對(duì)包合物進(jìn)行特征鑒別，可為中藥類揮發(fā)油的β-CD包合工藝提供借鑒。

1 材料和儀器

1.1 材料

肉桂（亳州市尚品堂中藥飲片有限公司，批號(hào)：2104001），β-環(huán)糊精（安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號(hào)：A21091206），本研究所用無水乙醇、甲醇等試劑均為分析純。

1.2 儀器

恒溫水浴鍋（上海力辰邦西儀器有限公司，型號(hào)：HH-4）；電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠，型號(hào)：JJ300）；揮發(fā)油測(cè)定器（泰興市銘泰科教儀器設(shè)備有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（上海維科檢驗(yàn)儀器有限公司，型號(hào)：UV-3226DC）；磁力攪拌器（江蘇金壇實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司，型號(hào)：DJL-3352）。

2 方法和結(jié)果

2.1 包合物制備方法

根據(jù)日常生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究采用飽和水溶液攪拌法制備肉桂揮發(fā)油包合物。精密稱量適量β-CD 置于無水干燥的錐形瓶中，加入兩倍量的純化水，將錐形瓶置于恒溫水浴鍋中，溫度控制在80 ℃，緩慢攪拌至溶解后形成飽和溶液，加入適量肉桂揮發(fā)油，保持適當(dāng)溫度、攪拌速度和時(shí)間，制備完成后降至室溫，傾去上清液，過濾所得沉淀用少量水洗，室溫下減壓真空干燥即為揮發(fā)油包合物［3］。

2.2 包合效果評(píng)價(jià)指標(biāo)

郭誠誠等［4］研究結(jié)果顯示，揮發(fā)油包合效果的最關(guān)鍵考察指標(biāo)為揮發(fā)油包合率，包合率越高說明包合效果越好，但單純依靠揮發(fā)油包合率無法全面評(píng)價(jià)包合效果。包合物收得率是工藝穩(wěn)定性、工業(yè)化生產(chǎn)的重要參考指標(biāo)［5］，為此本研究選擇包合物收得率作為次要考察指標(biāo)。根據(jù)國內(nèi)外參考文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果，本研究將包合物收得率和揮發(fā)油包合率作為考察指標(biāo)，兩者權(quán)重系數(shù)分別為0.3 和0.7。根據(jù)上述兩個(gè)考察指標(biāo)水平和權(quán)重系數(shù)計(jì)算包合工藝總評(píng)分，總評(píng)分越高說明包合效果越好。空白回收率實(shí)驗(yàn)操作為：精密量取1 mL 肉桂揮發(fā)油置于250 mL 容量瓶中，加入純化水定容至刻度，按照《中國藥典》2020 版四部通則2204 揮發(fā)油測(cè)定法（甲法）測(cè)定揮發(fā)油收集量，揮發(fā)油收集量占揮發(fā)油加入量即得，揮發(fā)油密度參考《中國藥典》2020 版四部通則0601 相對(duì)密度測(cè)定法，重復(fù)檢測(cè)三次取平均值［6］。具體計(jì)算方法見如下公式。

2.3 單因素考察

2.3.1 揮發(fā)油與β-CD 比例 精密量取5 份1 mL 肉桂揮發(fā)油分別置于5 個(gè)無水干燥的錐形瓶中，分別加入精密稱量的3 g、5 g、7 g、9 g、11 g 的β-CD，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備包合物，并計(jì)算揮發(fā)油與不同質(zhì)量β-CD 的包合工藝總評(píng)分。從表1 中可見，當(dāng)投料比（揮發(fā)油與β-CD 比例）為1∶5 時(shí)總評(píng)分最高，因此選擇與1∶5 總評(píng)分相近的1∶7 和1∶9三個(gè)因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.2 包合溫度 精密量取5 份1 mL 肉桂揮發(fā)油分別置于5 個(gè)無水干燥的錐形瓶中，分別加入精密稱量的7 gβ-CD，按照“2.1”項(xiàng)下方法加入β-CD兩倍量的純化水，采用飽和水溶液攪拌法制備揮發(fā)油包合物，并計(jì)算不同包合溫度下的包合工藝總評(píng)分。從表1 中可見，當(dāng)包合溫度為40 ℃時(shí)，包合工藝總評(píng)分最高，本研究選擇與包合溫度40 ℃總評(píng)分相近的35 ℃、45 ℃兩個(gè)因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表1 不同單因素水平對(duì)包合效果的影響

2.3.3 包合時(shí)間 精密量取5 份1 mL 肉桂揮發(fā)油分別置于5 個(gè)無水干燥的錐形瓶中，分別加入精密稱量的7 gβ-CD，按照“2.1”項(xiàng)下方法加入β-CD兩倍量的純化水，采用飽和水溶液攪拌法制備揮發(fā)油包合物，并計(jì)算不同包合時(shí)間下的包合工藝總評(píng)分，從表1 中可見，當(dāng)包合時(shí)間為80 min 時(shí)，包合工藝總評(píng)分最高，因此本研究選擇與80 min 相近的60 min、100 min 三個(gè)因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝

本研究考察的三個(gè)單因素分別為A（投料比）、B（包合溫度）、C（包合時(shí)間），通過計(jì)算不同包合工藝的總評(píng)分，判斷三個(gè)不同單因素水平對(duì)包合效果的影響，具體見表2。從表3 的L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果可見，投料比是影響包合效果的主要因素，影響順次為A1＞A2＞A3；不同包合時(shí)間的影響次序?yàn)镃2＞C3＞C1；不同包合溫度的影響次序?yàn)锽2＞B1＞B3；根據(jù)不同包合工藝最終總評(píng)分可知，肉桂揮發(fā)油β-CD 包合物的最佳工藝條件為A1B2C2，即投料比1∶5，包合溫度40 ℃，包合時(shí)間80 min。方差分析可見投料比與包合溫度、包合時(shí)間比較，投料比對(duì)包合效果有顯著影響（P＜0.05），具體見表4。

表2 包合工藝正交試驗(yàn)因素水平表

表3 揮發(fā)油包合工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 包合工藝影響因素方差分析表

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)選定的最佳工藝條件，按照“2.1”項(xiàng)下的飽和水溶液攪拌法連續(xù)制備3 批次肉桂揮發(fā)油β-CD 包合物，并分別檢測(cè)3 批次包合物的揮發(fā)油包合率和包合物收得率，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算包合工藝總評(píng)分。驗(yàn)證試驗(yàn)3 批次包合物的揮發(fā)油包合率、包合物收得率、總評(píng)分均與正交試驗(yàn)各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的最大值接近，由此說明，正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳工藝重現(xiàn)性好、穩(wěn)定可靠，具體驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 優(yōu)選包合工藝驗(yàn)證結(jié)果

2.6 包合物特征鑒別

2.6.1 薄層色譜鑒別 分別制備4份樣品進(jìn)行薄層色譜鑒別，4 份樣品分別為β-CD 飽和溶液（1 號(hào)）、肉桂揮發(fā)油（2 號(hào)）、肉桂揮發(fā)油β-CD 包合物（3 號(hào)）、包合物中提取的肉桂揮發(fā)油（4 號(hào)），薄層色譜板為硅膠G 薄層色譜板，顯色劑為0.1%二硝基苯肼乙醇溶液，展開劑為石油醚∶乙酸乙酯（19∶2），4 份樣品在同一薄層板上點(diǎn)樣。薄層色譜結(jié)果顯示，2 號(hào)樣品和4 號(hào)樣品在相同位置出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，兩份樣品的Rf 值基本一致，此結(jié)果說明包合過程沒有改變?nèi)夤饟]發(fā)油的化學(xué)性質(zhì)；1 號(hào)樣品和3 號(hào)樣品在相同位置沒有出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，此結(jié)果說明肉桂揮發(fā)油已經(jīng)被完全包合，包合物表面沒有殘留，同時(shí)證實(shí)肉桂揮發(fā)油與β-CD 并非簡單的物理混合，而是完全形成了包合物。

2.6.2 紫外特征鑒別 分別制備四份樣品進(jìn)行紫外掃描特征鑒別，四份樣品分別為β-CD 乙醇溶液（1號(hào)）、肉桂揮發(fā)油乙醇溶液（2 號(hào)）、肉桂揮發(fā)油與β-CD 物理混合的乙醇溶液（3 號(hào)）、肉桂揮發(fā)油β-CD 包合物乙醇溶液（4 號(hào)），四份樣品均采用無水乙醇制備，四份樣品紫外掃描結(jié)果顯示，4 號(hào)樣品的最大吸收波長為307.8 nm，3 號(hào)樣品的最大吸收波長為303.7 nm，2 號(hào)樣品的最大吸收波長為300.4 nm，揮發(fā)油從物理混合至形成包合物的最大吸收波長紅移超過7 nm。

3 討論

肉桂中含有的揮發(fā)油是其發(fā)揮助陽祛寒、通脈溫腎功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，肉桂揮發(fā)油非常不穩(wěn)定，長時(shí)間存放會(huì)出現(xiàn)質(zhì)地黏稠和顏色加深，這主要源于揮發(fā)油的分解和氧化，為避免肉桂揮發(fā)油的揮發(fā)和氧化［7］，β-CD 包合技術(shù)是最有效、成本相對(duì)最低的方法。β-CD 的空間結(jié)構(gòu)為環(huán)狀空腔低聚物，空腔是由7 個(gè)葡萄糖分子連接而成，葡萄糖分子之間以α-1，4-糖苷鍵相互連接，形成內(nèi)部疏水、外部親水的中空環(huán)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部疏水性質(zhì)有利于包合揮發(fā)油類物質(zhì)［8］，且β-CD 內(nèi)部中空結(jié)構(gòu)孔徑在0.8 nm 左右，被包合客分子能形成超微粒分散物，相應(yīng)制劑的生物利用度和溶出速率也會(huì)提高［9］。β-CD 和被包合客分子之間借助范德華力形成穩(wěn)定的包合物，兩者之間不會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，整個(gè)包合過程完全屬于物理過程，被包合客分子的原有性質(zhì)和藥理作用不會(huì)發(fā)生改變［10］，加上β-CD 本身無任何藥理活性作用和不良反應(yīng)，因此β-CD 包合技術(shù)安全可靠。如果被包合客分子具有刺激性、不良?xì)馕叮?CD 包合技術(shù)還能降低刺激性和不良反應(yīng)，同時(shí)掩蓋客分子不良?xì)馕逗吞岣吲R床服藥依從性［11］。β-CD 包合技術(shù)還能將揮發(fā)油類物質(zhì)制備成固體粉末，有利于將液體藥物制備成固體制劑［12］。

肉桂揮發(fā)油包合工藝的早期研究方向主要集中在包合方法上，如研磨法、飽和水溶液法、超聲法等，不同包合方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)被包合客分子性質(zhì)、設(shè)備條件等選擇合適的方法［13］。本研究選擇飽和水溶液法進(jìn)行肉桂揮發(fā)油包合，重點(diǎn)研究了包合影響因素的參數(shù)，為選出不同單因素的最優(yōu)水平，考察了不同單因素的3 個(gè)水平的揮發(fā)油包合率、包合物收得率和工藝總評(píng)分，通過比對(duì)上述3 個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，最終選出的最佳包合工藝為A1B2C2。根據(jù)最佳工藝制備的3 批次包合物的揮發(fā)油包合率、包合物收得率、總評(píng)分均與正交試驗(yàn)各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的最大值接近，驗(yàn)證結(jié)果說明本研究正交試驗(yàn)優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可靠。為進(jìn)一步驗(yàn)證包合效果符合預(yù)期結(jié)果，本研究對(duì)包合物分別進(jìn)行了紫外掃描和薄層色譜的特征鑒別，實(shí)驗(yàn)說明揮發(fā)油被包合后并未發(fā)生性質(zhì)改變，且肉桂揮發(fā)油被β-CD 完全包合，而不是簡單的物理混合，紫外掃描顯示空白揮發(fā)油、物理混合物及包合物的最大吸收波長均發(fā)生了紅移。綜上所述，本研究優(yōu)化工藝制備的包合物出現(xiàn)了新的物相特征，且制備工藝穩(wěn)定可靠。