HPLC 法測定巖鹿乳康膠囊中水晶蘭苷的含量

趙俊雄，和祎

怒江傈僳族自治州食品藥品檢驗(yàn)所，云南 瀘水 673199

中國云南滇西少數(shù)民族地區(qū)有著比較悠久的少數(shù)民族醫(yī)藥文化及傳承歷史，巖鹿乳康膠囊是基于彝族醫(yī)藥理論研究形成的經(jīng)典名方，并具有民間用藥經(jīng)驗(yàn)及臨床驗(yàn)證支持，在治療胸脅、腹脹痛及婦女乳癖方面有較為顯著的療效而被滇西少數(shù)民族廣泛使用。彝族醫(yī)藥是我國民族醫(yī)藥重要組成部分，彝族醫(yī)藥理論認(rèn)為，巖鹿乳康膠囊功效為“補(bǔ)知?jiǎng)P扎諾，且凱色土”，可益腎，活血，軟堅(jiān)散結(jié)，主要用于治療腎陽不足、氣滯血瘀等導(dǎo)致的乳腺增生癥［1］。該藥是由巖陀、鹿銜草、鹿角霜組成的一種中藥膠囊劑，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS-10306（ZD-0306）-2002-2011Z 僅對(duì)處方中的巖陀有效成分巖白素的含量進(jìn)行了定量控制，但未對(duì)鹿銜草有效成分進(jìn)行定量控制［2］。鹿銜草具有活血調(diào)經(jīng)、祛風(fēng)除濕、補(bǔ)虛益腎等功效，具有祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨、止血、止咳的功效，用于治療風(fēng)濕痹痛、腎虛腰痛、腰膝無力、月經(jīng)過多、久咳勞嗽等［3］，是該藥處方中的重要組成部分，為更全面有效地控制巖鹿乳康膠囊的質(zhì)量，保證該品種用藥安全有效，本研究采用HPLC 法測定巖鹿乳康膠囊中鹿銜草的主要有效成分水晶蘭苷的含量。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent 1260 高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器，AgilentChemStation 色譜工作站）；分析天平（梅特勒托利多電子天平XS205DU，十萬分之一）；分析天平（梅特勒托利多電子天平AE240，萬分之一）。試藥:巖鹿乳康膠囊(批號(hào)：20200602、20201203、20210201)樣品生產(chǎn)企業(yè)為云南海灃藥業(yè)有限公司；對(duì)照品為水晶蘭苷（批號(hào)：111870-202004，供含量測定用，含量以96.5%計(jì)，來源為中國食品藥品檢定研究院）。自制陰性樣品；甲醇(色譜純，德國默克)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；其他使用的試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent EclipseXDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95），流速為1.0 mL/min；檢測波長為235 nm，進(jìn)樣量10 μL，在當(dāng)前色譜條件下理論塔板數(shù)為8 619。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖：A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性樣品溶液

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取樣品內(nèi)容物（《中國藥典》四部通則中裝量差異項(xiàng)下），先研細(xì)并充分混勻，取約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入純水50 mL，稱定重量，在80 ℃水浴鍋中回流提取1 h，先放冷，再稱定重量，然后用水補(bǔ)足所減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，往殘?jiān)屑舆m量水使充分溶解，溶解后完全轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，定容，搖勻，過濾，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取水晶蘭苷對(duì)照品10.48 mg，置100 mL 容量瓶中，加水溶解后并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL 中含水晶蘭苷101.13 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。再精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL置25 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度即得每1 mL 中含水晶蘭苷4.045 2 μg 的對(duì)照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 精密稱取按處方工藝不含鹿銜草的陰性樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 線性關(guān)系的考察

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下的水晶蘭苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1、2、2.5、3、4、6 mL，分別置于25 mL 量瓶中，加水定容制成濃度分別為4.045 2、8.090 4、10.113 0、12.135 6、16.180 8、24.271 2 ug/mL 的系列對(duì)照品溶液，分別吸取上述各濃度對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下相關(guān)條件分析，記錄峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出水晶蘭苷回歸方程Y=13.975X-2.576 7（r=0.999 7，n=6）,結(jié)果表明水晶蘭苷的進(jìn)樣量在40.452～242.712 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取巖鹿乳康膠囊，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，每份分別取0.4 g，精密稱定，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行測定并計(jì)算，結(jié)果測得每粒巖鹿乳康膠囊中水晶蘭苷的平均含量為0.12 mg，RSD=1.2%。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次進(jìn)樣量為10 μL，記錄峰面積，結(jié)果水晶蘭苷峰面積的RSD 值為1.37%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按上述色譜條件取“2.2.1”項(xiàng)下制備的供試品溶液，分別在0，2，4，18，24 和30 h 分別進(jìn)樣10 μL 并測定峰面積，結(jié)果水晶蘭苷峰面積的RSD值為0.96%，說明供試品溶液室溫放置在30 h 內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批（批號(hào)：20210201）樣品6份，各約0.4 g，精密稱定，分別置于6個(gè)錐形瓶中，精密量取并加入上述錐形瓶中質(zhì)量濃度為101.13 μg/mL 的水晶蘭苷對(duì)照品溶液各1 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備所需供試品溶液，分別測定供試品溶液中待測物的含量，計(jì)算并得出水晶蘭苷的平均回收率為98.78%，RSD 為 0.61%（n=6），結(jié)果詳見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.8 含量測定

按上述色譜條件，依法測定3 批樣品中水晶蘭苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 化學(xué)成分的確定

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)得出［4-7］，黃酮類物質(zhì)是鹿銜草中的主要成分，提取純化工藝基本為醇提，但由于醇提黃酮類物質(zhì)的工藝成本較高，導(dǎo)致在工業(yè)化生產(chǎn)中不太適用。故本試驗(yàn)采用以水為溶劑提取鹿銜草中化學(xué)成分，通過方法學(xué)驗(yàn)證，其有效成分水晶蘭苷能被有效提取并分離，能達(dá)到《中國藥典》規(guī)定的鹿銜草中水晶蘭苷最低下限值［8］，所以本研究確定水晶蘭苷為指標(biāo)用于測定巖鹿乳康膠囊中鹿銜草的含量。

3.2 檢測波長的確定

為了保證水晶蘭苷的測定能有較好的靈敏度，根據(jù)高效液相色譜二極管陣列檢測器上測得的紫外吸收光譜圖以選擇水晶蘭苷的檢測波長。以甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95）為溶劑制備對(duì)照品溶液，經(jīng)檢測該溶液在235 nm 處有最大吸收，所以選擇檢測波長為235 nm。

3.3 流動(dòng)相的確定

水晶蘭苷是一種偏酸性化合物，經(jīng)考察在磷酸緩沖溶液條件下才能得到理想的分離效果［9］。故在流動(dòng)相的選擇與確定方面，首先采用了乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果待測成分存在分離不好的情況。當(dāng)流動(dòng)相以甲醇-0.4%磷酸水溶液（15∶85）、甲醇-0.1%磷酸水溶液（5∶95）兩種不同濃度及比例的磷酸水溶液流動(dòng)相分別進(jìn)行考察時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種流動(dòng)相的檢測結(jié)果顯示水晶蘭苷的分離效果較好，含量測定結(jié)果重復(fù)性好，基線比較平穩(wěn)，色譜峰形狀對(duì)稱，能達(dá)到《中國藥典》規(guī)定要求，然而隨著磷酸濃度的不斷增大,分離效果卻未能有明顯的改善，需充分考慮分離效果及色譜柱的PH 耐受范圍，故確定甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95）作為流動(dòng)相。

3.4 樣品的提取方法確定

提取溶劑選擇方面，分別考察了40%甲醇、70%甲醇、90%甲醇和水等多種溶劑，結(jié)果表明采用水作為提取溶劑時(shí)有效成分水晶蘭苷的提取效果較好且能被較好分離，故采用水為該方法的提取溶劑。最佳提取方式選擇方面，本研究曾分別考察回流提取、超聲提取兩種提取方式，有效成分水晶蘭苷的提取結(jié)果表明采用回流提取效果最佳；在回流提取溫度和時(shí)間的選擇和確定方面，經(jīng)考察多種回流溫度及時(shí)長,結(jié)果表明在80 ℃回流提取1 h的條件下效果最佳。

4 結(jié)論

鹿銜草含量測定項(xiàng)目在巖鹿乳康膠囊原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的缺失，導(dǎo)致該藥品的質(zhì)量不能進(jìn)行較好地控制。為使處方中鹿銜草中有效成分含量測定方法與《中國藥典》2020 年版一部中鹿銜草中水晶蘭苷的質(zhì)量控制一致，最終確定采用HPLC 法測定巖鹿乳康膠囊中水晶蘭苷的含量，并通過了方法學(xué)驗(yàn)證，該研究方法學(xué)驗(yàn)證下的各項(xiàng)指標(biāo)都能達(dá)到定量測定的相關(guān)要求。

綜上所述，該研究方法操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定且可靠。因此，本方法可用于巖鹿乳康膠囊中水晶蘭苷的含量測定，以此來進(jìn)一步控制巖鹿乳康膠囊的質(zhì)量。