固相萃取-液相色譜-串聯質譜法測定藥用蜂蜜中雙酚類化合物

于暉，謝慧英，周鴻，胡航

江西省疾病預防控制中心，江西省食源性疾病診斷溯源重點實驗室，江西 南昌 330029

蜂蜜作為中藥材收載于《中國藥典》2020 年版一部［1］，也是蜜丸的重要輔料來源［2］，具有補中、潤燥、解毒、止痛等藥用功效，用于肺燥干咳、脘腹虛痛、腸燥便秘等。黃芪蜂蜜、三七蜂蜜、枸杞蜂蜜、黨參蜂蜜、枇杷蜂蜜、益母草蜂蜜等藥用蜂蜜對慢性病具有良好的輔助醫療作用［3-4］，深受大眾的喜愛。然而人們往往忽視了存儲蜂蜜的容器給人體帶來潛在危害。聚碳酸酯和環氧樹脂等有機材料，因其具備一定的抗沖撞性和輕便性［5］，成為人們用來存儲蜂蜜的常用容器。由于聚碳酸酯和環氧樹脂等合成材料的重要組成原料為雙酚類化合物［6-7］，包括雙酚A（bisphenol A,BPA），雙酚F（bisphenol F,BPF）和雙酚S（bisphenol S,BPS）。雙酚類化合物對內分泌系統、生殖系統、免疫系統、神經系統等具有潛在的生理毒性，并具有一定的致畸性和致癌性，可導致動物生殖細胞的畸形和繁殖率的下降［8-10］。目前雙酚類化合物的研究大多集中于谷物、肉類、桶裝水等食品的檢測［11-13］，而藥用蜂蜜中雙酚類化合物對人體健康造成潛在的危害方面報道較少［14］。因此準確測定藥用蜂蜜中雙酚類化合物，為研究藥用蜂蜜中雙酚類化合物對人體健康的影響有著重要意義。

由于多壁碳納米管是一種具有良好吸附能力的納米材料，本研究利用羧基化石墨多壁碳納米管凈化樣品，聯合超高效液相色譜—串聯三重四級桿質譜法，建立一種快捷靈敏高效、精準穩定，適用于藥用蜂蜜中雙酚A、雙酚F 和雙酚S 的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-30A 超高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB SCIEX QTRAP ○R5500 三重四級桿質譜儀（美國AB Sciex 公司）；TGL-16M 型高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；1-16K 小型高速（冷凍）離心機（德國Sigma 公司）；SK8200HP 型超聲波清洗機（上海科導超聲儀器有限公司）；Vortex-5 型渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；MG-2200 型氮吹儀（日本理化器械株式會社）。

乙腈中BPA 標準物質（100 μg/mL）、乙腈中BPS 標準物質（100 μg/mL）、乙腈中BPA-D4 標準物質（100 μg/mL）和甲醇中BPS-13C12 標準物質（100 μg/mL）均購自天津阿爾塔科技有限公司；甲醇中BPF 標準物質（10 mg/mL）購自美國AccuStandard公司；BPF-13C6 標準物質（純度≥98.0%）購自加拿大TRC 公司；乙腈、甲醇、甲酸（質譜級，美國Merck 公司）；乙酸乙酯、丙酮（色譜級，美國Merck 公司）；羧基化多壁碳納米管（MWCNTs-COOH，純 度≥95%，直 徑8～15 nm，長 度50 μm）和羧基化石墨多壁碳納米管（GMWCNTs-COOH，純度≥99.9%，直徑8～15 nm，長度10-50 μm）均購自南京吉倉納米科技有限公司；HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL）購自美國Waters 公司。10 批藥用蜂蜜樣品購自藥店（批號分別為企業A：20 210126；企業B：20 191111；企業C：20 200401；企業D：20 200113；企業E：20 200805；企業F：20 210210；企業G：20 201218；企業H：20 200305；企業I：20 200101；企業J：20210220）。

1.2 標準溶液配制

1.2.1 標準使用液配制 用初始流動相稀釋，配制成BPA 和BPF 濃 度均為500 ng/mL、BPS 濃度 為100 ng/mL 的標準使用液。

1.2.2 同位素內標使用液配制 用初始流動相稀釋，配制成BPA-D4 和BPF-13C6 濃度均為100 ng/mL、BPS-13C12 濃度為20 ng/mL 的內標使用液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 試樣提取 稱取混勻的樣品1.0 g于50 mL離心管中，加入100 μL 同位素內標使用液（1.2.2），加入25 mL 20%乙腈水溶液，渦旋混勻，超聲提取20 min，以8 000 r/min于4 ℃離心5 min，上清液全部轉移至另一50 mL 離心管中，加50 μL 甲酸，渦旋混勻，待凈化。

1.3.2 凈化 準確稱取90.0 mg GMWCNTs-COOH，裝填成兩端有篩板的聚丙烯固相萃取柱，經12 mL甲醇和6 mL 純水活化平衡，上樣，6 mL 20%甲醇水溶液淋洗，用6 mL 甲醇-丙酮（4:1）洗脫，洗脫液氮吹至近干，用1 mL 初始流動相溶解殘渣，于12 000 r/min 離心1 min，收集上清液待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：10 ℃；流動相：A，水；B，甲醇；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫程序為：0～5 min，20%B～100% B；5～6 min，100% B；6～6.1 min，100%B～20% B；6.1～9 min，20% B。進樣量：2 μL。

1.4.2 質譜條件 離子源：ESI（-）；離子噴霧電壓4 500 V；離子源溫度120 ℃；脫溶劑溫度：550 ℃；氣簾氣：35.0 L/h ；采用多反應監測掃描模式（MRM）進行采集。目標離子采集質譜參數見表1，目標化合物MRM 譜圖見圖1。

圖1 BPA、BPF和BPS總離子圖

表1 BPA、BPF、BPS及同位素內標的保留時間和質譜分析參數

2 結果與討論

2.1 固相萃取填料的選擇

比 較GMWCNTs-COOH、MWCNTs-COOH 和HLB 3種固相萃取柱對BPA、BPF 和BPS 的吸附效率，當樣品添加水平為40 μg/kg 時，分別過GMWCNTs-COOH、MWCNTs-COOH 和HLB3種固相萃取柱，BPA、BPF 和BPS 的絕對回收率見圖2。結果表明GMWCNTs-COOH、MWCNTs-COOH和HLB3種固相萃取柱對BPA、BPF 和BPS 的吸附效率為：GMWCNTs-COOH＞MWCNTs-COOH＞HLB。因 此選擇GMWCNTs-COOH 作為固相萃取填料。這是因為碳納米管具有共軛平面結構，相比于HLB 柱填料，與BPA、BPF 和BPS 的作用力較強［15］，而GMWCNTs-COOH 比MWCNTs-COOH石墨化程度高，缺陷較少，因此三種固相萃取柱中GMWCNTs-COOH 對BPA、BPF 和BPS 的吸附效率最高。

圖2 不同固相萃取填料對BPA、BPF和BPS的吸附效率

2.2 固相萃取柱中GMWCNTs-COOH 柱容量的優化

分別考察了不同柱容量的GMWCNTs-COOH 固相萃取柱（30 mg、60 mg、90 mg、120 mg）對3 種目標化合物的回收率影響，結果見圖3。

圖3 不同柱容量對BPA、BPF和BPS的影響

實驗表明BPA、BPF 和BPS 的絕對回收率隨著GMWCNTs-COOH 柱容量的增大而增大，當固相萃取柱的柱容量大于90 mg 時，BPA、BPF、BPS的絕對回收率變化趨于平穩，因此固相萃取柱中GMWCNTs-COOH 柱容量為90 mg。

2.3 洗脫溶劑的選擇

分別采用甲醇-丙酮（4:1）、乙酸乙酯、乙腈作為洗脫溶劑，對吸附在GMWCNTs-COOH 上的目標物進行洗脫，洗脫效率見圖4。結果顯示：甲醇-丙酮（4∶1）的洗脫效果優于乙酸乙酯和乙腈。因此選擇甲醇-丙酮（4∶1）作為洗脫溶劑。

圖4 不同洗脫溶劑對BPA、BPF和BPS的洗脫效果

2.4 標準曲線、檢出限和定量限

配制BPA、BPF質量濃度為1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L，BPS 質量濃度為0.20 μg/L、0.40 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、4.0 μg/L、10 μg/L，同位素內標BPA-D4、BPF-13C6 濃度為10 μg/L，BPS-13C12 濃度2.0 μg/L 系列標準混合溶液，上機測定。以目標化合物和內標峰面積比值為縱坐標，目標化合物濃度為橫坐標繪制標準曲線。使用3 倍信噪比（S/N=3）計算檢出限，10 倍信噪比（S/N=10）計算定量限。3 種目標化合物的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限和定量限見表2。

表2 3種目標物的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限和定量限

2.5 加標回收率和精密度

在蜂蜜中添加低、中、高三個水平標準溶液，每個水平6 份平行，按方法進行處理測定，BPA、BPS 和BPF 的平均加標回收率為87.7%～105.2%，RSD 為2.4%～5.3%。結果見表3。

表3 樣品蜂蜜中3種目標物的加標回收率和精密度（n=6）

2.6 實際樣品分析

使用本方法對10 份市售蜂蜜進行檢測，其中1 份蜂蜜檢出BPA，BPA 含量為3.9 μg/kg，BPS 和BPF 均未檢出，結果見圖5。

圖5 樣品中雙酚A（BPA）及其內標子離子圖

3 結論

本實驗考察了采用不同固相萃取填料對藥用蜂蜜樣品中BPA、BPF 和BPS 的提取效率并建立了固相萃取-超高效液相-串聯三重四級桿質譜同時測定藥用蜂蜜中BPA、BPF 和BPS 的分析方法。本實驗表明羧基化石墨多壁碳納米管（GMWCNTs-COOH）有較好的吸附效果，且凈化效果明顯。同時實驗使用同位素內標法定量，確保方法靈敏度、準確度和精密度均能夠滿足方法學檢驗要求。

本方法操作簡便、準確、穩定，滿足于大批量藥用蜂蜜中BPA、BPF 和BPS 的檢測需求，為進一步開展藥用蜂蜜中雙酚類化合物對人體健康危害評估提供了技術支撐。