參白藥效部位納米混懸劑的劑型工藝優化及其升白作用的研究

簡鳳嬌，郭敏，吳沛杭，李孝棟

(福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122)

據世界衛生組織統計[1]，截至2020年底，全球惡性腫瘤發病例已達1 929萬，死亡人數高達995萬人。在腫瘤化療過程中，最常見的毒副作用是骨髓抑制，突出表現為白細胞減少癥[2-3]。白細胞作為免疫系統的重要組成部分，一旦持續減少，將使機體處于易感染狀態，極大降低腫瘤化療的治療效果和預后，嚴重者可引起死亡[4]。臨床上，西醫主要通過口服或注射升白藥物、成分輸血以及胚胎干細胞移植等方法治療白細胞減少癥，雖然短期療效顯著，但常常伴有不良反應且治療費用高[5-6]。中藥基于中醫辨證論治的理念，已廣泛應用于化療患者，具有多靶點、長效、毒副作用小的優勢，如八珍湯、參苓白術散等[7-8]。但中藥成分復雜，存在使用周期長、見效慢的缺點，開發以有效部位為原料的中藥制劑可提高中藥的治療效果[9]。

參白方出自譚支紹教授主編的《藥用寄生》，主要由黃芪、銀耳、黨參、絞股藍等組成，用于治療癌癥放化療后的白細胞減少癥[10]。文獻[11-14]顯示黃芪多糖、銀耳多糖、黨參多糖以及絞股藍皂苷對白細胞減少癥均具有良好的治療效果，故以總多糖與總皂苷為參白方的主要有效部位。多糖為大分子物質，難以透過細胞膜的磷脂雙分子層；總皂苷以絞股藍皂苷為主，溶于水后易析出[15-16]。納米混懸劑具有提高藥物溶出度與促進吸收等優點[17-18]，多糖具有一定的黏性，能降低藥物粒子的沉降速度，減少穩定劑的使用，克服納米混懸劑物理穩定性差的問題。本文以參白方提取的總多糖與總皂苷混合物為藥物原料，采用高壓均質技術，開展參白有效部位納米混懸劑(Shenbai Effective Parts Nanouspension，SBEP-NS)劑型工藝的研究，對優化制得的納米混懸劑進行表征和升白藥效的研究，為參白方納米新劑型的研發奠定基礎。

1 材料

1.1 動物 清潔級小鼠[合格證號：SCXK(閩)2016-0002]，體質量(20±2)g，雄性，由福建醫科大學實驗動物中心提供。小鼠于動物籠中飼養，環境溫度為(20±2)℃，濕度為(45%±3%)，可自由飲食。

1.2 試藥 大豆卵磷脂(上海源葉生物科技有限公司，批號：20211011)；十二烷基硫酸鈉(西隴化工股份有限公司，批號：1506012)；吐溫80(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20171207)；泊洛沙姆188(北京鳳禮精求商貿有限責任公司，批號：WPCE634B)；注射用環磷酰胺(Baxter Oncology GmbH，批號：0E384A)；生理鹽水(福州海王福藥制藥有限公司，批號：國藥準字H35020289)；地榆生白片(成都地奧集團天府藥業股份有限公司，批號：國藥準字Z20026497)；血細胞分析用溶血劑(天津海邁醫用科技有限公司，批號：12006132)；血細胞分析用稀釋液(天津海邁醫用科技有限公司，批號：12109021)；總多糖粗提物(含量47%)與總皂苷粗提物(含量30%)由本課題組制備。

1.3 儀器 AH-100D高壓均質機(加拿大ATS公司)；pocH-100iV Diff全自動血液分析儀(日本SYSMEX株式會社)；Nicomp 380ZLS激光粒度電位檢測儀(美國PSS粒度儀公司)；JJ-2組織搗碎勻漿機(常州金壇良友儀器有限公司)；H-7650透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)。

2 方法

2.1 總多糖的提取 稱取銀耳180 g、黃芪和黨參各450 g，浸漬30 min，加入25倍量的清水煎煮3次，每次煎煮4 h，過濾，合并濾液，濃縮至含總生藥材1 g·mL-1。濃縮液中加入4倍量的95%乙醇，靜置過夜，抽濾，將濾餅干燥后即得總多糖。

2.2 總皂苷的提取 稱取絞股藍675 g，合并“2.1”項下總多糖提取的藥渣，加入8倍量80%乙醇浸泡30 min，回流提取2次，每次2 h，過濾，合并兩次濾液，濃縮至含總生藥材1 g·mL-1。將濃縮液用3倍量水飽和正丁醇溶液萃取3次，合并水飽和正丁醇層，回收正丁醇，干燥即得總皂苷。

2.3 SBEP-NS的制備 稱取總多糖和總皂苷粗提物各2.5 g，加入50 mL溶有適量穩定劑的蒸餾水溶液中，組織勻漿機1 000 r·min-1下分散3 min，得粗混懸液；粗混懸液在高壓均質壓力下，循環均質，得到SBEP-NS。

2.4 單因素試驗

2.4.1 穩定劑篩選 固定藥物與穩定劑的比例為1∶1，穩定劑分別為大豆卵磷脂、吐溫80、十二烷基硫酸鈉(SDS)、泊洛沙姆188，按“2.3”項下方法制備粗混懸液。各粗混懸液在800 bar壓力下，均質15次，制得納米混懸劑。測定上述各納米混懸劑的粒徑與PDI，靜置后觀察其沉降與聚集現象。

2.4.2 穩定劑的用量 使藥物與大豆卵磷脂的質量比為2∶1、1∶1、1∶2，按“2.3”項下方法制備粗混懸液，粗混懸液于800 bar壓力下，均質循環20次，制得SBEP-NS并測定粒徑，考察大豆卵磷脂的用量對SBEP-NS粒徑的影響。

2.4.3 均質壓力 固定藥物與大豆卵磷脂的質量比為1∶1，按“2.3”項下方法制備粗混懸液，粗混懸液分別在200、400、600、800、1 000 bar壓力下，均質循環20次，得SBEP-NS并測定粒徑。

2.4.4 均質次數 固定藥物與大豆卵磷脂的質量比為1∶1，按“2.3”項下方法制備粗混懸液，粗混懸液在800 bar均質壓力下，分別均質2、4、6、8、10、12、14、16、18、20次，得SBEP-NS并測定粒徑。

2.5 正交試驗

2.5.1 正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，以藥物與大豆卵磷脂的質量比(A)、均質壓力(B)、均質次數(C)為主要影響因素，各因素水平見表1。根據正交試驗表，按“2.3”項下方法分別制備SBEP-NS，以粒徑(X)和PDI(Y)為評價指標優化SBEP-NS的制備工藝。

表1 正交因素水平

2.5.2 優化結果的驗證 按優選工藝平行制備3批SBEP-NS，并測定其粒徑與PDI，驗證正交優化結果。

2.6 正交樣品的沉降考察與納米混懸劑的表征

2.6.1 沉降的考察 取正交試驗的9批SBEF-NPS，在室溫下放置，分別于第1、2、4個月觀察各正交樣品的沉降狀態。

2.6.2 形態觀察 取優選工藝制備的SBEP-NS稀釋至6.25 mg·mL-1，取20 μL滴至銅網上，晾干，滴加4%磷鎢酸溶液染色，靜置5 min后用濾紙從銅網邊緣吸干多余液體，置于透射電鏡下觀察形態。

2.6.3 粒徑、多分散指數及Zeta電位測定 按優選工藝平行制備3批SBEP-NS，分別取適量稀釋4倍后置于粒徑分析儀上，分別測定粒徑、PDI和Zeta電位。

2.7 升白藥效實驗

2.7.1 分組造模與給藥 健康ICR小鼠60只，隨機分為空白組、模型組、地榆升白片0.12 g·kg-1陽性對照組[19]、SBEP-NS 1、2、4 g·kg-1低中高3個劑量組，每組10只。飼養3 d后，除空白組外，其余各組小鼠均腹腔注射環磷酰胺(CTX)80 mg·kg-1，連續3 d，復制化療所致的白細胞減少模型[20-21]。造模完成后，各藥物組灌胃給予相應劑量的藥物混懸液，空白及模型組給予等容積的生理鹽水，20 mL·kg-1，每天1次，連續15 d。

2.7.2 外周血白細胞(WBC)計數 造模后第7、15天，給藥30 min后，分別取各組小鼠眼眶血，全血細胞自動分析儀上檢測白細胞數量。

2.7.3 免疫器官指數 造模后第15天，稱量小鼠體質量(g)，脫頸處死后，取小鼠胸腺與脾臟，稱量重量(mg)并計算免疫器官指數(免疫器官指數=免疫器官質量/小鼠體質量)。

3 結果

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 穩定劑的篩選 加入等量的穩定劑，在相同的制備條件下，加入大豆卵磷脂制得的SBEP-NS粒徑最小且穩定，結果見表2。結果表明，大豆卵磷脂最適合作為穩定劑。

表2 穩定劑的篩選

3.1.2 穩定劑用量的篩選 在同一條件下，由圖1可知，隨著大豆卵磷脂用量的增加，SBEP-NS粒徑逐漸減小，當藥物與大豆卵磷脂質量比為1∶2時，粒徑最小。

圖1 穩定劑比例對粒徑的影響

3.1.3 均質壓力對粒徑的影響 由圖2可知，隨著壓力的增加，粒徑逐漸減小，當均質壓力為800 bar時，粒徑最小。故選擇700、800、900 bar作為正交試驗因素水平。

圖2 均質壓力對粒徑的影響

3.1.4 均質次數對粒徑的影響 在相同的制備條件下，考察不同均質壓力對SBEP-NS粒徑的影響，由圖3可知，均質14次時，SBEP-NS的粒徑最小。

圖3 均質次數對粒徑的影響

3.2 正交試驗與驗證 按照正交試驗設計進行SBEP-NS的制備工藝優化，由表3～4可知，A因素(藥物與大豆卵磷脂的質量比)、B因素(均質壓力)、C因素(均質次數)對SBEP-NS的粒徑影響由大到小為C>A>B，選取的最佳工藝為A2B2C2，即藥物與大豆卵磷脂的質量比為1∶1.50，在800 bar壓力下，均質14次。正交優選工藝驗證結果見表5，結果表明：優選工藝制得的SBEP-NS粒徑小且分布均勻，由此可判斷，優選的工藝可行、穩定。

表3 正交試驗設計與結果

表4 方差分析

表5 SBEP-NS制備工藝正交驗證結果

3.3 正交樣品的沉降考察與納米混懸劑的表征

3.3.1 沉降考察 由圖4所示，放置4個月后，第1號至第5號樣品出現明顯粒子沉降和霉變現象，而第6號至第9號樣品仍處于穩定狀態，上述最佳工藝制得的樣品也位于其間，進一步證明了正交最佳劑型工藝確定的準確性。

圖4 正交樣品的沉降觀察 注：從左往右依次是第1、2、4月

3.3.2 形態觀察 由圖5可知，SBEP-NS的粒子間無黏連現象，多為球形或類球形囊泡狀結構，可能與穩定劑大豆卵磷脂的雙親性結構有關。

圖5 SBEP-NS透射電鏡圖

3.3.3 粒徑、多分散指數及Zeta電位測定 SBEP-NS的平均粒徑為(141.4±2.46)nm，PDI為0.025±0.002，Zeta電位為(-31.47±0.26)mV。SBEP-NS粒徑較小，分散均勻(見圖6)。Zeta電位均小于-30 mV，說明體系處于穩定狀態。

圖6 SBEF-NPS的粒徑分布圖

3.4 升白藥效實驗 由表6可知，第7天測得的高劑量組白細胞水平顯著高于模型組、陽性藥組與其他劑量組；第15天時，SBEP-NS各劑量組的白細胞水平高于模型組與陽性藥組，具有統計學意義，效果優于地榆升白片。SBEP-NS高劑量組的胸腺指數顯著高于模型組與陽性藥組；SBEP-NS各劑量的脾臟指數均大于模型組，高劑量組與空白組、陽性藥組組間無顯著性差異，說明SBEP-NS對環磷酰胺所致的胸腺、脾臟萎縮有良好的恢復作用，效果與地榆升白片相當，結果見圖7～8、表6。

圖7 小鼠外周血白細胞數

圖8 小鼠免疫器官指數

表6 SBEP-NS對小鼠外周血白細胞和免疫器官指數的影響

4 討論

本實驗以參白方中的總多糖和總皂苷為研究對象，由于多糖分子量較大，皂苷的水溶性差，故將其制成納米混懸劑以提高生物利用度。本實驗采用高壓均質法制備納米混懸劑，相較于沉淀法，可以減少有機試劑的使用，提高安全性。前期試驗，對泊洛沙姆188、SDS、大豆卵磷脂和吐溫80等不同類型的穩定劑進行了考察，綜合考慮粒徑、PDI與沉降現象等多個指標，最終確定以大豆卵磷脂為穩定劑。大豆卵磷脂通過吸附在藥物粒子表面，提供電荷斥力，防止藥物粒子的聚集，以維持SBEP-NS的穩定性。通過正交試驗結果可知，均質壓力對粒徑的影響最大，重復驗優選工藝，制得的SBEP-NS粒徑小于正交試驗所得納米混懸劑的最小粒徑，說明優選工藝穩定可行。根據透射電鏡圖可知，SBEP-NS為囊泡狀，可能因為大豆卵磷脂是一種兩親性結構，它可能與皂苷和多糖類成分形成復合物或將其包裹，從而能夠幫助提高藥物的腸吸收程度和生物利用度。另外，最佳劑型工藝制得的納米混懸劑處于未發現明顯沉降的樣品6號至9號之間，說明中藥總多糖和絞股藍總皂苷等有效部位與大豆卵磷脂的混合有助于納米混懸劑的穩定，加上升白藥效的良好結果，證明了參白有效部位納米混懸劑劑型優化工藝確定的可靠性。至于樣品6號至9號顯示無霉變的機制，可能與大豆卵磷脂的用量較大以及和有效部位藥物形成膠束的充分度有關，具體原因有待進一步的研究。

從藥效實驗結果發現，環磷酰胺會導致小鼠白細胞水平顯著降低，而SBEP-NS對白細胞減少有一定的恢復作用，在給藥15 d后，小鼠白細胞水平已經恢復，且超過正常水平，這可能與小鼠出現免疫亢進現象有關[19]。環磷酰胺作為廣譜的抗腫瘤藥物，不具有特異性，也會殺傷正常細胞，可導致免疫器官的萎縮，故以免疫器官指數作為輔助參考指標。實驗結果表明，環磷酰胺對胸腺和脾臟有明顯的抑制作用，給藥15 d后，小鼠的胸腺指數仍然保持在較低的水平，而脾臟指數已經有大幅度的恢復，這就說明SBEP-NS對胸腺和脾臟抑制有恢復作用，但是在短期內無法解除環磷酰胺對小鼠胸腺的抑制影響。通過比較分析，高劑量組與地榆生白片在升高白細胞的作用上療效相當，在恢復免疫器官指數作用上，高劑量組優于地榆生白片。綜上，通過高壓均質法制得的SBEP-NS粒徑較小，分布均勻，且能維持穩定，對環磷酰胺所致的白細胞減少癥具有良好的恢復作用。