雞血藤微型飲片的制備工藝研究

張穎奇，張凡，賈天柱

(遼寧中醫藥大學藥學院,遼寧 大連 116600)

雞血藤為豆科植物密花豆(SpatholobussuberectusDunn)的干燥藤莖，味苦、甘，溫，歸肝、腎經。具有活血補血，調經止痛，舒筋活絡的功效。可用于月經不調，痛經，經閉，風濕痹痛，麻木癱瘓，血虛萎黃[1]。雞血藤中含有黃酮[2]、酚類[3]、甾醇[4]、木脂素類[5]、萜類[6]、揮發油類[7]化學成分，經現代研究分析，具有抗腫瘤[7]、抗氧化[8]、抗病毒[9]、鎮靜、催眠[10]等作用。但雞血藤傳統飲片切片較大、較厚，臨床使用時，飲片中有效成分難以煎出，又增加了臨床調劑時的難度，因許多中藥飲片都存在著該種問題，許多專家學者進行了有益探索，提出了中藥新型飲片的概念，包括配方顆粒、超微飲片、破壁飲片等種類，有利于促進提高中藥藥物質量均一性及可控性，也使中藥飲片的使用更加高效便利。但這些新的飲片藥用形式，卻脫離了組方合煎的中醫用藥理論，在此問題的基礎上，遼寧中醫藥大學的賈天柱教授提出“微型飲片”的概念。中藥微型飲片即在傳統中藥飲片的制片基礎上，在外形上將飲片以大化小[11]，從而提高飲片的利用效率。中藥微型飲片形式在臨床調劑時，更滿足多種藥品煎煮的個性需求[12]，在中藥的組方合煎、分級用藥等用藥理論方面也具有明顯優勢。本試驗以此為基礎，以加水量、粒徑、悶潤時長、干燥溫度為影響因素，以煎膏率、成品率、流動性、活性成分煎出率為綜合評價指標，優選出具有最佳有效成分煎出率和最大流動性的雞血藤微型飲片，以推動微型飲片改革，建立規格嚴謹、智能調劑的中藥微型飲片調劑體系，且進一步提高雞血藤飲片有效成分的煎出率，提高飲片的利用率。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695-2998型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；KQ-250DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；METTLERAE240型十萬分之一天平(瑞士METTLER)；烘箱(WS70B-型)；FA1004B電子天平(上海精密儀器有限公司)。

1.2 藥材 雞血藤藥材，購自安徽省六安市，并根據中國藥典2020年版自行鑒定為豆科植物密花豆(SpatholobussuberectusDunn)的干燥藤莖。

1.3 試劑與試藥 兒茶素和表兒茶素購自大連美侖生物技術有限公司，批號分別為AF8030202和N1106AS，純度均>98%；甲醇是色譜醇，其他試劑有乙醇，水是超純水。

2 方法與結果

2.1 雞血藤微型飲片煎出率的測定

2.1.1 溶液的制備

2.1.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取兒茶素對照品5.19 mg，表兒茶素5.49 mg分別置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度后搖勻，分別制得0.207 6 mg·mL-1兒茶素和0.219 6 mg·mL-1表兒茶素的對照品溶液。

2.1.1.2 供試品溶液的制備 稱取雞血藤微型飲片5 g于250 mL錐形瓶中，加20倍水，直火加熱，水煎液沸后用文火煎煮1 h，濾過后將藥液置于恒重的蒸發皿中，于沸水浴上濃縮至干，用少許甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶，搖勻，過0.45 μm的微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.1.2 色譜條件與系統適應性條件 色譜柱：Thermo C18色譜柱(4.6 mm×250 nm，5 μm)；流動相A：5‰醋酸-水，流動相B：甲醇。梯度洗脫：0～20 min，15% B；20～33 min，15% B變至25% B，流速為0.8 mL·min-1；檢測波長為270 nm；室溫檢測[13]。對照品和供試品的HPLC色譜圖見圖1。

A.混合對照品；B.雞血藤微型飲片供試品 1.兒茶素；2.表兒茶素圖1 雞血藤混合對照品及樣品HPLC圖

2.2 方法學考查

2.2.1 線性范圍的考察 兒茶素線性范圍考察：分別吸取兒茶素對照品1、2、3、5、8、10 μL，注入高效液相色譜儀(HPLC)中并測定峰面積。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得出回歸方程為：Y=767 559X-16 054，r=0.999 9。表明兒茶素在0.207 6～2.076 μg的進樣量范圍內，呈良好線性關系。

表兒茶素線性范圍考察：分別吸取表兒茶素對照品1、2、3、5、8、10 μL，注入HPLC中并測定峰面積。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得出回歸方程為：Y=908 004X-47 226，r=0.999 9。表明表兒茶素在0.219 6～2.196 μg的進樣量范圍內，呈良好線性關系。

2.2.2 精密度試驗 分別精密吸取“2.1.1.1”項下制備的兒茶素及表兒茶素對照品溶液，連續進樣6次，每次10 μL，注入HPLC中，按“2.1.1”項下的色譜條件，測定其峰面積，結果得出兒茶素和表兒茶素峰面積RSD值分別為1.38%和1.54%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣10 μL，測定各色譜峰面積，結果得出兒茶素和表兒茶素峰面積RSD值分別為1.25%和1.65%，表明24 h內，供試品的穩定性良好。

2.2.4 重復性試驗 取6份雞血藤微型飲片，按“2.1.1.2”項下方法制備供試品溶液。分別吸取各供試品溶液10 μL，按照“2.1.2”項下色譜條件，對6份樣品中兒茶素和表兒茶素的含量進行測定。結果得出樣品中RSD值分別為1.49%和1.35%，表明該方法重復性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 精密稱定已知兒茶素和表兒茶素的雞血藤微型飲片6份，每份0.02 g，分別置于100 mL容量瓶中，分別加入相應量的兒茶素對照品(0.207 6 mg·mL-1)和表兒茶素對照品(0.219 6 mg·mL-1)，按“2.1.2.2”項下的方法制備供試品，按照“2.1.1”項下的色譜條件測定含量，計算加樣回收率，結果見表1～2。

表1 兒茶素的加樣回收率測定結果

兒茶素的回收率在98.49%～101.76%之間，RSD為1.25%，符合有關規定。

表2 表兒茶素的加樣回收率測定結果

表兒茶素的回收率在98.36%～101.39%之間，RSD為1.08%，符合有關規定。

2.3 雞血藤微型飲片成品率的測定 雞血藤常規飲片低溫干燥，控制水分含量小于8%。取干燥后常規飲片藥材100 g，使用清水悶軟后，切制為微型飲片規格，控制含水量小于8%，稱定雞血藤成品微型飲片的質量，并計算其成品率[14]。

成品率%=微型飲片成品的質量(g)/藥材質量(g)×100%。

2.4 雞血藤微型飲片煎膏率的測定 取雞血藤微型飲片5 g，于8倍量冷水中浸泡40 min，直火加熱至水沸后，改為文火加熱30 min，濾過后藥液備用；取藥渣，加6倍量水繼續煎煮，水沸后改用文火煎煮20 min，濾過。兩次濾過后的藥液混合，定容至100 mL容量瓶中。精密稱取50 mL，置于恒重的蒸發皿中，架于水浴鍋上濃縮至干，再放入105 ℃的烘箱中烘干至恒重，稱量所得煎膏重，計算煎膏率[14]。

煎膏率%=[煎膏重(g)×2]/微型飲片取樣量(g)×100%

2.5 雞血藤微型飲片流動性的測定 采用休止角法進行測定。稱取20 g雞血藤微型飲片，置于圓形容器中，倒扣，置于水平的桌面上，迅速地抬起容器，觀察飲片自行滑落形成的傾斜角度。設傾斜角的高度為H，底邊為L，計算微型飲片休止角為θ。

tanθ=H/L

2.6 正交試驗 以加水量、粒徑、悶潤時長及干燥溫度作為雞血藤微型飲片的考察因素，各個因素設計了3個水平,具體因素的水平表見表3。試驗以煎膏率、成品率、流動性以及兒茶素和表兒茶素的煎出率為考察指標,并根據每個指標的影響程度設計了正交試驗。按照各項指標的貢獻程度設定權重,并實行綜合評價。正交試驗設計表見表4，方差分析表見表5。

表3 因素水平表

表4 正交試驗設計表

表5 方差分析表

由方差分析結果可知，因素D(干燥溫度)是引起雞血藤微型飲片中兒茶素和表兒茶素含量變化的主要因素；由極差分析結果可以看出，各項影響因素的影響順序主次為D(干燥溫度)>A(加水量)>C(悶潤時長)>B(粒徑)，從綜合評分來看最佳工藝可以定位A2B3C1D2，但從方法分析來看因素B粒徑大小在所設定的水平內沒有顯著性差異，故在節約時間與能源的考慮下，選擇3水平。綜合分析，確定雞血藤微型飲片的最佳制備工藝為A2B3C1D2，即每100 g雞血藤藥材悶潤加水量10 mL，粒徑規格0.6～0.8 mm，悶潤時長2 h，干燥溫度60 ℃。

3 討論

雞血藤微型飲片流動性測量方法的選擇。本試驗考查雞血藤不同規格粒徑微型飲片的流動性時，發現不同規格的雞血藤微型飲片，在流動時間測定儀中，會堵塞機器進出口，難以流下。因此選用休止角方法，根據飲片堆積層的自由斜面與水平面形成的最大角，來比較不同規格微型飲片的流動性大小，角度越小對應的該規格雞血藤微型飲片的流動性越好。最終得出粒徑為0.6～0.8 mm的微型飲片流動性最佳。

供試品溶液制備方法的選擇。經查閱文獻發現[15]，雞血藤中兒茶素與表兒茶素在70%乙醇溶劑中提取度最高。但在臨床使用時，雞血藤微型飲片的煎煮溶劑為水而非醇提取，所以考慮到雞血藤微型飲片在實際應用中的藥用效果，本次試驗在進行對雞血藤中兒茶素與表兒茶素的含量測定時，選擇使用水煎液而非醇提取。

含量測定指標的選擇。中藥雞血藤飲片中含有原兒茶素、兒茶素、表兒茶素、甘草素、芒柄花素、美迪紫檀素等化學成分，其中表兒茶素和兒茶素的含量較高，其他4個成分的含量相對較低[16]。現代研究表明，兒茶素是從雞血藤乙酸乙酯活性部位中所提取的含量最高的單體化合物[17]，具有促造血、抗氧化、抗凋亡作用[18]；表兒茶素與兒茶素單體富集產生原青花素，展示出很強的抗氧化能力，能作為雞血藤飲片等級評價的指標之一[17]。本次試驗選用靈敏度高、重復性好且操作簡單的HPLC法為對雞血藤微型飲片中的表兒茶素及兒茶素進行含量測定，為雞血藤不同規格微型飲片的質量標準提供一定的參考依據。

本試驗以加水量、粒徑、悶潤時長、干燥溫度為影響微型雞血藤飲片的主要因素，并以這4種因素作為正交試驗，以兒茶素和表兒茶素含量作為質量水平的評價指標，選出最佳的雞血藤微型飲片炮制工藝。優選出的雞血藤微型飲片的最佳炮制工藝為每100 g雞血藤藥材悶潤加水量100 mL，粒徑規格0.6～0.8 mm，悶潤時長6 h，干燥溫度60 ℃。

中藥飲片是臨床應用、調劑制劑、新藥開發的前提和基礎，必須有明確的基原，穩定的質量和可靠的療效[19]。微型飲片與傳統常規飲片相比，其飲片體積減小，同提取溶劑的接觸面積變大，所以其有效成分的提取更完全，在煎出率水平上表現更優，達到了高煎出率，有利于臨床的使用和中藥研究。且由于其體積減小，流動性也更理想，更滿足智能調劑的需求。飲片能達到高流動、高煎出，才能實現智能調劑和智能煎制[20-21]。故微型飲片具有廣闊的臨床應用和研究前景。