甜瓜育種技術與方法研究進展

宋正峰　劉樹森　夏連芹　高鵬　欒非時　劉釗

摘 ? ?要：系統綜述了近年來國內外甜瓜育種技術與方法的研究進展，特別是甜瓜二代與三代基因組測序，轉錄組、蛋白質組與代謝組學研究方法，重要基因定位及前景選擇技術，DNA指紋圖譜及背景選擇技術，遺傳轉化體系、基因編輯等基因工程技術，以及雙單倍體育種等細胞工程技術領域的研究進展，并對我國甜瓜育種技術與方法研究工作進行了展望，以期為廣大甜瓜育種工作者提供參考。

關鍵詞：甜瓜;育種技術與方法;分子育種;生物技術育種

中圖分類號：S652 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2022）06-001-08

Advances of melon breeding technology and method

SONG Zhengfeng LIU Shusen XIA Lianqin GAO Peng LUAN Feishi LIU Zhao

（1. Shouguang Sanmu Seeding Co.， LTD， Shouguang 262704， Shandong， China; 2. Weifang College of Science and Technology， Weifang 262700， Shandong， China; 3. Horticulture and Landscape Architecture College， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， Heilongjiang， China）

Abstract： We reviewed the recent progress in the field of melon breeding technologies and methods with focuses on the research progress in the second and third generation of genome sequencing， transcriptomics， proteomics and metabolomics research methods， important trait discovery and foreground selection， DNA fingerprinting and background selection， genetic transformation， gene editing system and other genetic engineering technologies， doubled haploid breeding and other cell engineering technologies in melon. Finally， the research work on melon breeding technologies and methods in China was prospected. We hope to provide reference for melon breeders.

Key words： Melon; Breeding technology and methods; Molecular breeding; Biotechnology breeding

甜瓜（Cucumis melo L.）屬于世界十大水果型蔬菜，富含礦物質、維生素等人體必需的營養成分，是人們生活中不可缺少的園藝產品，在國民經濟中占有十分重要的位置[1]，在世界園藝產業領域也占有舉足輕重的地位。FAO統計顯示，我國甜瓜生產面積與產量均居世界首位，2020年我國甜瓜生產面積38.8萬hm（占世界總面積的36.31%），產量達1 386.5萬t（占世界總產量的48.71%）。“十三五”以來，經過廣大甜瓜育種工作者的不懈努力，我國甜瓜遺傳學基礎、功能基因組學、育種技術等領域的研究水平已經趕上乃至超越西班牙、美國、以色列、土耳其、日本、韓國等傳統甜瓜科研強國，處于世界前列。尤其是近3年來，我國學者創建了多種甜瓜關鍵性狀前景選擇技術體系及成熟的全基因組背景選擇技術體系，使甜瓜分子標記輔助選擇技術日趨成熟;在甜瓜基因工程育種中實現了基因編輯技術的突破;傳統育種結合分子育種手段創制出一批抗性好、品質優的育種材料，育成眾多優質、抗逆的甜瓜新品種，并在生產上大面積推廣應用，促進了甜瓜產業的快速發展，助力了脫貧攻堅和鄉村振興[2]。筆者對甜瓜育種技術與方法領域研究進展進行了綜述，重點著眼于最新研究成果及實用分子育種手段的闡述，以期為我國甜瓜育種工作者開展分子育種研究提供參考。

1 甜瓜組學研究進展

組學一般包括基因組學、轉錄組學、蛋白質組學及代謝組學。這些組學中基因組學是基礎，尤其是作物參考基因組的發布，為后續分子標記開發、基因定位進而實現分子育種等研究奠定了基礎。而轉錄組學、蛋白質組學及代謝組學則為挖掘關鍵基因、闡明基因功能提供了工具。

1.1 甜瓜參考基因組研究

2012年西班牙學者首次發表了甜瓜參考基因組（v3.5.1）[3]，該參考基因組采用雙單倍體厚皮甜瓜材料DHL92為材料，以羅氏454平臺為主要測序手段，基因組測序結果顯示，甜瓜核型為2n=2x=24，基因組規模約為375 Mb;2018年該團隊在原有基礎上又發表了新版本的甜瓜參考基因組（v3.6.1）[4]，基因組和注釋信息質量得以提升。參考基因組的發表使得大規模開發分子標記進行基因定位及分子標記輔助選擇成為可能，通過第二代測序技術了解育種材料遺傳背景、開發實用分子標記、進行基因精細定位已經成為常規研究手段。

近3年來，三代測序技術不斷發展，2019年新疆農業科學院伊鴻平團隊利用第三代測序技術（SMRT）與Hi-C技術結合，拼接了更加完備的甜瓜參考基因組[5]，所用材料為厚皮甜瓜Payzawat，這是三代測序技術應用于甜瓜基因組拼接的首次報道。2020年浙江大學張明方團隊利用三代測序技術結合Hi-C輔助組裝方式完成了典型薄皮甜瓜材料HS的基因組組裝[6]。三代測序技術最大的優勢在于具有較長的讀長，可以保證基因組拼接的完整性，便于比較不同材料或亞種間的染色體變異，為今后獲得高質量參考基因組乃至泛基因組奠定基礎。

除了核基因組圖譜之外，在甜瓜細胞器基因組測序和組裝方面，東北農業大學西甜瓜分子育種團隊對甜瓜細胞器基因組進行了測序，并將之與核基因組進行了比較分析，證明了在甜瓜進化過程中，核基因組與細胞質中的2個細胞器基因組之間發生了大量遺傳物質交換[7]。最近，也有了對甜瓜野生近緣材料馬泡瓜葉綠體基因組進行測序組裝的報道[8]。

1.2 甜瓜轉錄組學、蛋白質組學及代謝組學研究

轉錄組學是指用第二代測序等方法對生物轉錄產物進行高通量定性、定量分析。轉錄組測序可以快速挖掘差異表達基因并明確基因調控關系，甜瓜參考基因組數據的發表為甜瓜轉錄組測序、拼接及數據分析提供了便利，現在轉錄組測序手段已經成為甜瓜重要基因挖掘、基因功能分析、基因調控網絡構建的重要手段。目前，針對甜瓜各種性狀的轉錄組測序數據已有很多，包括甜瓜抗病[9]、脅迫響應[10]、果實品質[11]、發育[12]及花性別分化[13]等，這些轉錄組數據都可以在數據庫中獲得，為國內外學者研究相關性狀并克隆基因奠定了基礎。除了利用轉錄組學手段研究編碼基因的表達特性，還有學者關注miRNA等非編碼RNA的表達特性，由此衍生出了小分子RNA測序及降解組測序等技術[14-15]，這些手段為深入研究非編碼RNA功能提供了條件。

轉錄組學研究只能揭示轉錄水平的差異，為了研究翻譯水平的調控，有些學者已經開始進行蛋白質組學研究，如Serra-Soriano等[16]研究了甜瓜在病毒感染過程中韌皮部汁液的蛋白質組學變化，發現相對于健康植株，病毒感染植株25個蛋白質點豐度發生了顯著改變，其中的大多數蛋白質參與氧化還原反應與細胞凋亡過程，這些結果為闡明甜瓜抗病毒機制提供了幫助。以往蛋白質組學研究手段主要是蛋白質雙向電泳，現在多為利用飛行時間質譜儀（time of flight mass spectrometer，TOF）等高通量手段。目前，進行轉錄組測序研究的主要問題是，測序結果會給出很多差異表達基因，如何在這些大量基因中找到關鍵基因是未來研究的主要課題，結合遺傳連鎖圖譜以及基因/QTL定位研究，將有效縮小基因篩選范圍，將遺傳學數據與轉錄組數據相互結合更容易發現關鍵基因。

近年來，代謝組學成為學者越來越重視的研究手段，代謝組學通過質譜等高通量測定植物代謝產物，甜瓜很多性狀都與代謝產物密切相關，尤其是果實香氣、風味與代謝物密不可分。得益于質譜技術等功能越來越強大，儀器價格越來越低，代謝組學和蛋白質組學逐漸成為分析甜瓜復雜性狀的有力工具。比如，中國農業科學院蔬菜花卉研究所王懷松團隊利用代謝組學手段分析了甜瓜果皮顏色的形成機制[17];Nagashima等[18]利用代謝組結合轉錄組學手段分析了甜瓜果實發育過程中芳香氣體形成的機制。

另外，進入21世紀以來，表型組學（phenomics）的研究理念越來越受到重視。所謂表型組是指某一生物的全部性狀特征，而植物表型組學是研究植物生長、表現和組成的科學，能夠有效追蹤基因型、環境因素和表型之間的聯系，是未來作物學研究和應用的關鍵領域[19]。植物表型組學研究需要特定的自動化儀器，對擬南芥等模式植物和水稻等株型、規模有限的作物已經有比較成熟的方案，由于甜瓜表型豐富、株型復雜，目前還沒有甜瓜表型組學研究的相關報道。

綜上所述，對基因組學、轉錄組學、蛋白組學及代謝組學等方法的綜合利用越來越成熟，通過合理設計試驗可以為破解甜瓜復雜性狀形成機制、挖掘重要基因開啟一條捷徑。

2 甜瓜重要基因定位及分子標記輔助選擇

2.1 甜瓜重要基因定位及前景選擇技術

進入21世紀以來，已經在甜瓜的12條染色體上獲得了大量的重要性狀相關位點，涉及到的性狀包括甜瓜抗病性、果實品質、發育等多個方面。表1總結了其中性狀貢獻率大、定位穩定、定位區間相對精細并可以用于分子輔助育種的基因位點，可以利用這些位點信息設計合適的分子標記，完成特定性狀的前景選擇。

有了上述基因的序列信息即可設計分子標記開展前景選擇育種工作，也可以將多個優良基因進行整合實現分子聚合育種。在分子標記方面，以SSR為代表的第二代分子標記具有操作簡單的優勢，應用比較廣泛。但最新挖掘的功能基因大多數是以SNP、InDel等第三代分子標記進行定位的，所以直接應用位于基因上或與基因緊密連鎖的第三代分子標記進行選擇育種越來越成為主流。目前，以SNP為代表的第三代分子標記在甜瓜育種實踐中主要基因分型手段包括以下幾種：（1）SNP-CAPS（cleaved amplified polymorphic sequence，酶切擴增多態性序列）標記，就是將SNP標記轉化為CAPS標記，通過PCR之后限制性內切酶消化進行基因分型的手段[26]，該方法便于操作，但SNP位點須位于限制性酶切位點上;（2）real-time PCR，利用Taqman探針等手段進行SNP基因分型[57]，該方法依賴于real-time PCR儀，適用于樣本規模較大但標記數量較少的情況;（3）LGC-KASP（kompetitive allele specific PCR，競爭性等位基因特異性PCR）是近年興起的高度自動化相對高通量的SNP基因分型手段[58]，該手段依賴于儀器，且儀器價格較貴;（4）基因芯片，是自動化程度水平很高和試驗成本最低的高通量SNP基因分型手段[59]，但芯片設計成本很高，在甜瓜上適用于大規模基因分型芯片的報道還很少。上述方法需育種者結合自身情況靈活運用。

2.2 甜瓜DNA指紋圖譜及背景選擇技術

分子標記除了可以進行基因定位和選擇育種外，也可以廣泛應用于種質資源鑒定。2012年，Gao等[60]通過對國內主栽甜瓜品種的指紋圖譜分析發現，我國甜瓜種子市場存在較多同物異名、同名異物現象，并得出我國薄皮甜瓜遺傳背景相當狹窄的結論。為了解決這一系列問題，他們從1219個SSR中篩選到18對SSR引物作為DNA指紋圖譜的核心引物，利用該核心引物構建了471份中國甜瓜主栽品種與骨干親本的DNA核酸指紋圖譜，這是第一套甜瓜分子指紋圖譜系統，可以區分主流商業甜瓜品種，并且利用其中個別多態性標記可以快速在雜交種中找到混雜的母本種子，為種質資源鑒定提供了依據。該系統主要有2個優點：一是核心標記為SSR標記，操作簡單，尤其育種企業使用比較便利;二是標記多態性信息豐富且覆蓋甜瓜全部12條染色體，品種及種質資源區分效果較好。

但由于核心標記數量較少，上述系統作為快速鑒定種質資源尚可，難以作為全基因組背景選擇的工具。隨著基因組學的發展，尤其是近5年高通量測序及基因分型技術的普及，以SNP為代表的第三代分子標記逐漸代替SSR標記作為甜瓜種質資源鑒定的主要手段。2019年出現了利用32個核心SNP引物的甜瓜分子指紋圖譜技術[61]。

隨著可以應用的多態性分子標記越來越多，標記覆蓋染色體的密度越來越大，分子指紋圖譜技術可以過渡為背景選擇技術，實現甜瓜育種的全基因組選擇（genomic selection，GS）。該技術是利用覆蓋全基因組的高密度標記進行選擇育種的新方法，利用全基因組背景選擇結合個別優良性狀的前景選擇，可以快速將優良性狀（如抗性）導入育種材料中，實現骨干親本的快速改良。背景選擇結合前景選擇可通過早期選擇縮短世代間隔，保證育種值（genomic estimated breeding value，GEBV）估計的準確性等，加快遺傳研究進展，尤其對低遺傳力、難測定的復雜性狀具有較好的預測效果，真正實現了全基因組選擇技術指導育種實踐。目前，國內外各主要甜瓜育種單位正努力整合、建立成熟的甜瓜背景選擇技術體系，將用于甜瓜育種實踐。

前景選擇結合背景選擇的高效分子育種策略需要高通量基因分型手段，SNP等第三代分子標記是最優選擇。目前高通量SNP分型手段主要有LGC-KASP和基因芯片，其中，LGC-KASP已得到很好應用，目前還罕有甜瓜SNP分型芯片的報道。

以SSR為代表的第二代分子標記和SNP為代表的第三代分子標記相比較，第二代分子標記基因分型技術簡單、操作要求與成本較低，適合少數樣品的快速鑒定，而第三代分子標記可以實現高通量基因分型，技術和設備要求高，育種工作者可以根據實際情況靈活應用。相信指紋圖譜及背景選擇技術將會在甜瓜育種、品種鑒定、資源利用等領域得到越來越廣泛的應用。

3 甜瓜基因工程

3.1 甜瓜遺傳轉化體系

國際上甜瓜遺傳轉化的研究開始于20世紀90年代[62-64]，國內在該領域的研究也較早，成功轉化甜瓜的歷史可以追溯到1994年，新疆農業科學院獲得了抗黃瓜花葉病毒轉基因植株[65]。特別是2014年以來，甜瓜遺傳轉化技術取得了長足進步，相關研究報道較多[66-67]。

甜瓜基因工程的應用有以下2個方面：一是甜瓜抗病，如將病毒衣殼蛋白基因轉入甜瓜達到抗病毒病的目的[65，68]，以及將幾丁質酶等抗真菌基因轉入甜瓜達到抗真菌病的目的[69];二是對乙烯代謝相關基因進行改良，乙烯是植物中的重要生長調節劑，參與果實成熟、形態建成、花發育等多個生物學過程，有學者將乙烯合成途徑中關鍵酶基因的反義序列轉入甜瓜，達到降低果實乙烯含量、增強甜瓜耐貯藏性進而延長貨架期的目的[70]，還有將甜瓜中花發育關鍵乙烯相關基因CmACS-3進行超量表達，達到增加兩性花數、促進兩性花成熟效果的報道，該研究對育成易坐果、早熟、豐產的甜瓜材料具有重要意義[67]。目前，這些報道中所利用的遺傳轉化方法均為農桿菌介導的遺傳轉化，具體方式主要有子葉/子葉節法[65-67]、子房注射法[69]以及花粉管通道法[70]。上述方法中使用最多、轉化效率最穩定、應用潛力最大的是以子葉節為外植體的農桿菌介導的遺傳轉化法。

植物基因工程技術與理論已經成熟，然而其在甜瓜領域的應用與其他作物相比還不夠廣泛，主要原因是雖然甜瓜已經獲得高效的再生體系[71]，但缺乏高效、穩定、重復性好的遺傳轉化體系，國內很多研究團隊正在該領域進行深入研究，相信近期會有所突破。

3.2 甜瓜基因編輯技術

近5年來，隨著甜瓜遺傳轉化體系的日益完善，以CRISPR-Cas9系統為代表的基因編輯技術在育種和基礎研究中顯示出越來越大的潛力和優勢，已經有學者進行了甜瓜基因編輯的探索，如王雪等[72]構建了甜瓜ACC合成酶CRISPR-Cas9系統基因編輯載體;王丹等[73]構建了甜瓜全緣葉基因PLL的CRISPR/Cas9敲除載體。但上述2個例子只有基因編輯載體構建的報道，未見對甜瓜完成基因編輯并產生表型的報道。究其原因是目前基因編輯理論、方法和載體已比較成熟，但現有基因編輯體系依賴于農桿菌介導的遺傳轉化，還缺乏比較高效、穩定的甜瓜遺傳轉化體系。未來，隨著成熟甜瓜遺傳轉化體系的構建，基因編輯技術將會在育種實踐中發揮重大作用。

4 甜瓜細胞工程及倍性育種技術

總體上說，甜瓜細胞工程及倍性育種發展較為緩慢，在育種中并沒有得到大規模應用，現就該領域的研究歸納總結如下。

4.1 甜瓜細胞工程技術

目前，在甜瓜細胞工程領域進行的研究主要是甜瓜原生質細胞的培養和融合。國際上甜瓜原生質體培養研究始于1984年，西班牙學者率先發表了甜瓜原生質體培養及愈傷組織誘導的方法[74]，而國內相關研究晚于國外5年[75]。單純的原生質體培養并獲得再生植株的理論和實踐意義并不大，所以學者開始進行原生質體細胞融合的研究，主要對西瓜、甜瓜2種葫蘆科主要作物的原生質體進行融合[76-77]，誘導細胞融合的手段包括聚乙二醇介導的化學融合[77]和電融合[76]。目前還沒有通過細胞融合獲得甜瓜雜種植株的報道，其主要原因是西瓜與甜瓜親緣關系較遠，產生的雜交細胞染色體組難以穩定遺傳，其后代性狀分離嚴重、與常規材料雜交困難等。反之，利用甜瓜與其近緣野生種的原生質體雜交有可能獲得成功，可以通過這個方式快速獲得野生種優異性狀，有條件的機構可以考慮開展此項研究工作。

原生質體培養的另一個應用領域是通過原生質體完成誘變或外源基因導入，隨著化學誘變、農桿菌介導的遺傳轉化等手段的完善，原生質體培養技術在上述領域已沒有技術優勢，所以較少有人關注于此。

4.2 甜瓜雙單倍體育種

雙單倍體（doubled haploid或dihaploid，DH）即加倍后的單倍體，雙單倍體技術可快速獲得基因型純合的植株。雙單倍體技術在基礎研究領域可快速獲得永久作圖群體（DH群體）;在育種實踐上，雙單倍體技術可快速純合育種材料，固定優異基因。所以甜瓜雙單倍體技術具有巨大理論與實踐意義。

雙單倍體技術的第一步是獲得單倍體，而后再用秋水仙素對單倍體枝條進行加倍，加倍后枝條上的花進行自交授粉即可獲得穩定的雙單倍體后代。早在1987年法國學者利用輻射后的甜瓜花粉進行授粉，再通過胚挽救手段獲得甜瓜單倍體，進而用秋水仙素對單倍體進行加倍即可獲得雙單倍體[78]。受制于當時的技術條件，其單倍體誘導和加倍效率不高。2010年后，甜瓜雙單倍體的報道逐漸增多，但均為國外學者尤其是西班牙學者完成[79-80]，成功的雙單倍體研究普遍采用適合歐洲栽培的厚皮甜瓜材料作為親本進行單倍體誘導和加倍。我國這方面的報道還比較少[81]。由于國內甜瓜栽培類型豐富，涵蓋薄皮甜瓜和多種類型厚皮甜瓜，因此，迫切需要探索一種適合各種甜瓜類型的雙單倍體誘導技術。

4.3 三倍體無籽甜瓜育種

將普通二倍體用秋水仙素處理即可獲得四倍體，四倍體親本與二倍體親本雜交可產生三倍體雜種，三倍體植株在進行減數分裂時會出現聯會紊亂的情況，所以三倍體難以形成種子。目前，在葫蘆科作物上西瓜三倍體的應用已很廣泛。不同于三倍體無籽西瓜已經形成了較大的產業規模，三倍體甜瓜的研究很少，這主要是因為甜瓜的種子和可食用部分是分開的，無籽甜瓜經濟價值不高。

目前已報道的三倍體無籽甜瓜只有哈甜3號薄皮甜瓜品種[82]，三倍體薄皮甜瓜無成熟種子，具有甜度高、生長勢強、抗病性強等特點，但由于三倍體甜瓜種子出芽率低，限制了更大面積的推廣。

5 甜瓜育種技術與方法展望

隨著越來越多的甜瓜關鍵基因被克隆，今后除了繼續發掘、克隆、利用單基因決定性狀的關鍵基因，未來甜瓜育種技術研究還可以著眼于以下幾個領域：一是復雜性狀決定基因的克隆和利用;二是關注已克隆基因的功能解析，在明晰基因功能研究基礎上可以利用轉基因、基因編輯等手段改良性狀;三是最新技術成果轉化越來越快，與育種領域結合越來越緊密，包括三代測序、代謝組學、基因編輯、高通量表型分析系統等一系列新技術逐漸在甜瓜分子育種上成熟并顯示出優勢，研究者應充分利用;四是整合已有研究成果，建立多套相關性狀前景選擇技術體系，充分利用高通量基因分型平臺，整合出甜瓜背景選擇技術體系，形成高效分子育種新模式，真正使甜瓜育種進入分子育種時代。

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