籽用美洲南瓜種質遺傳多樣性分析及SSR指紋圖譜構建

張穎　王萍1　李二娜　田曉春　陳鵬

摘? ? 要：利用20對SSR引物分析48份籽用美洲南瓜種質的遺傳多樣性并建立指紋圖譜，為籽用美洲南瓜種質的親本選配、保護和鑒定提供依據。結果顯示，這20對引物在48份籽用美洲南瓜種質中擴增出115條具有多態性的等位基因，位點的Shannon信息指數（I）均值為1.36、遺傳多樣性指數（H）均值為0.69、多態性信息指數（PIC）均值為0.63。聚類分析顯示，20對SSR引物可將48份種質從0.659相似系數水平上分成兩大類。其中，第Ⅰ類包含46份種質，在遺傳相似系數為0.679處又將其分為3個亞類。第一亞類包含來自內蒙古巴彥淖爾市的15份種質和來自甘肅的18份種質，第二亞類包含來自新疆的10份種質，第三亞類包含來自山西的3份種質。第Ⅱ類包含了來自內蒙古呼倫貝爾市的2份種質。綜合各項指標篩選出5對SSR核心引物將48份籽用美洲南瓜種質完全區分并構建了指紋圖譜。

關鍵詞：籽用美洲南瓜;SSR標記;指紋圖譜;遺傳多樣性

中圖分類號：S642.1 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2022）06-009-07

Genetic diversity analysis and SSR fingerprinting of seed-use pumpkin（Cucurbita pepo L.）germplasm

ZHANG Ying WANG Ping LI Erna TIAN Xiaochun CHEN Peng

（1. College of Horticulture and Plant Protection， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010000， Inner Mongolia， China; 2. Agricultural Reclamation Economic Development Office of Inner Mongolia Agricultural and Animal Husbandry Technology Extension Center， Hohhot 010000， Inner Mongolia， China）

Abstract：Twenty pairs of SSR polymorphic primers with good polymorphism and clear bands were used to analyze genetic diversity of 48 seed-use pumpkin （Cucurbita pepo L.） germplasm by fingerprinting for the purpose of parent selection， protection and identification. 115 polymorphic bands were amplified from the 48 pumpkin germplasm. The average Shannon’s information index （I） was 1.36， the average genetic diversity index （H） was 0.69， the average polymorphism information content （PIC） was 0.63. Cluster analysis showed that 48 accessions could be divided into two categories from the level of 0.659 similarity coefficient. The first category includes 46 accessions under three subclasses at the genetic similarity coefficient of 0.679. The first subclass has 15 accessions from Bayannur City， Inner Mongolia and 18 accessions from Gansu， the second subclass has 10 accessions from Xinjiang and the third subclass has 3 germplasms from Shanxi. The second category includes two accessions from Hulunbuir， Inner Mongolia. Five pairs of core SSR primers were selected based on diversity indexes. Forty-eight pumpkin germplasm were completely distinguished using fingerprinting based on the five core SSR primer pairs.

Key words：Cucurbita pepo L.; SSR markers; Fingerprints; Genetic diversity

籽用美洲南瓜俗稱籽用西葫蘆（Cucurbita pepo L.），為葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita L.）草本植物，以種子作為主要食用器官。我國籽用美洲南瓜的生產主要集中在黑龍江、新疆和內蒙古三大產區，且出口量大，籽用美洲南瓜已成為重要的經濟作物和深具特色的出口創匯型作物[1-3]。目前生產上優良籽用美洲南瓜種質資源較少，且重復使用少數種質資源作為親本進行雜交育種，導致栽培種的遺傳背景較窄，且大多數栽培種的病害抵抗力較差，嚴重限制了籽用美洲南瓜種育種材料的創新與利用[4-6]。此外，作物育種發展不充分不平衡問題，使得有限的研究成果難以在育種上得到充分應用，在優良品種選育方面的貢獻率沒有達到預期[7-8]。

伴隨現代分子遺傳育種技術的飛速發展，在基因水平上指導南瓜品種的改良、選育，是開展籽用美洲南瓜種質資源遺傳多樣性研究、加快育種進程的重要步驟[9]。其中SSR（simple sequence repeat）分子標記技術因具有多態性豐富、重復性好、等位變異頻率高等優點，在植物的遺傳多樣性分析中得到了廣泛應用[10-11]。迄今為止，已有很多學者通過應用SSR分子標記技術對南瓜屬植物進行遺傳多樣性分析，王艷玲等[12]對南瓜屬的3個主要栽培種（中國南瓜、美洲南瓜、印度南瓜）的親緣關系進行分析，結果表明中國南瓜與美洲南瓜親緣關系較為相近，而印度南瓜則單獨在另一分支上，劉超[13]對76份籽用南瓜（籽用印度南瓜和籽用美洲南瓜）種質資源的遺傳多樣性進行研究，認為籽用南瓜的親緣關系受其生態型及其來源地影響較大。全面系統地構建指紋圖譜是快速厘清籽用美洲南瓜種質資源間的親緣關系、提升親本選配效率的重要舉措[14-15]。目前，利用SSR 分子標記技術，對玉米、大豆、小麥、水稻等[16-19]主要農作物指紋圖譜的研究較多，而籽用美洲南瓜在這方面的報道則很少見。筆者應用SSR分子標記技術對其48份種質的遺傳多樣性進行分析，并建立指紋圖譜，以期為籽用美洲南瓜種質資源的保護和創新利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用48份籽用美洲南瓜種質材料由內蒙古農業大學園藝與植物保護學院籽用瓜課題組提供，均為通過多年多代自交選擇獲得的純系材料，其主要農藝性狀如表1所示。于2021年5月23日采用隨機區組方式播種于內蒙古農業大學試驗田，每個小區20株，3次重復。同年8月采集生長旺盛期的植物嫩葉，用液氮急凍，-80 ℃保存備用。

1.2 基因組DNA的提取及引物合成

48份供試材料的基因組DNA用試劑盒（天根生化有限公司）進行提取，提取的DNA樣本通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量濃度，將DNA樣本質量濃度稀釋至30～50 ng·μL，-20 ℃保存備用。SSR標記共用引物50對，其序列從相關文獻[20]中獲得。所有引物均由上海生物工程技術公司合成。

1.3 引物篩選及PCR反應

以5份表型差異較為明顯的種質材料對50對引物進行初篩，初篩后選擇條帶清晰、多態性好的22對引物用于48份種質的遺傳多樣性分析。PCR反應體系為10 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物共1 μL，Taq Mix 5 μL，ddHO 2 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預熱變性3 min;94 ℃變性20 s，68 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，6個循環（退火溫度每個循環降2 ℃）;94 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，8個循環（退火溫度每個循環降1 ℃）;94 ℃變性20 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20個循環;72 ℃延伸5 min。

1.4 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

擴增產物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并通過硝酸銀染色檢測種質間的多態性。具體方法如下：30%丙烯酰胺21 mL，5×TBE buffer 14 mL，加蒸餾水定容至70 mL后加入10%的過硫酸銨700 μL溶液，配置70 mL的8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，最后在使用前加入50 μL的TEMED。待膠凝固后，將其與電泳槽組裝好，上下倒入1×TBE。在10 μL的PCR產物中加入2 μL的6×Loading Dye，混合均勻后進行點樣，每孔1 μL。點樣后接通電源，在175 V的電壓下電泳120 min左右，銀染后拍照記錄。

1.5 數據處理

對擴增片段大小在250 bp以下的條帶進行統計，用“1”和“0”兩種數字來表示條帶的分布情況，有條帶的位置用“1”表示，沒有條帶的位置用“0”表示，以此來獲得基礎的0/1矩陣。通過POWERMARKER 3.0分析引物多態性信息含量（PIC），使用軟件NTSYSPC2.10e對樣品進行聚類分析，利用POPGEN32分析觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Shannon信息指數（I）、遺傳多樣性指數（H）、期望雜合度（He）和觀測雜合度（Ho）。

2 結果與分析

2.1 引物多態性分析

從50對引物中篩選出了多態性好、條帶清晰明亮的20對引物對48份種質的基因組DNA進行PCR擴增，部分引物擴增效果如圖1所示。20對引物共擴增出122條清晰可統計的條帶，其中有115條多態性條帶，多態性百分率為94.26%。由表2可知，在本研究的20對引物中，引物CMTp141的PIC值最高，為0.90;引物CMTp18的PIC值最低，為0.44。所有引物的PIC值均介于0.44～0.90之間，平均多態性信息含量為0.63。20對引物的Na值在3～13之間，平均為5.65。Ne值在2.05～10.32之間，平均為3.58。由此可見20對引物間的觀測等位基因數與有效等位基因數有較大差異，說明等位基因在群體內存在分布不均的現象。20對引物的Ho值介于0.09～0.50之間，平均值為0.31。而He值介于0.52～0.91之間，平均為0.69，平均觀測雜合度小于平均期望雜合度。20對引物的I值在0.88～2.45之間，均值為1.36。其H值在0.51～0.90之間，均值為0.69。綜合以上各個指標，表明試驗所用的48份種質材料具有較為豐富的遺傳多樣性。

2.2 籽用美洲南瓜種質遺傳多樣性分析

根據這48份種質的來源地將其分為5個群體，群體A包含來自內蒙古巴彥淖爾市的15份種質;群體B包含來自甘肅的18份種質;群體C包含來自新疆的10份種質;群體D包含來自山西的3份種質;群體E包含來自內蒙古呼倫貝爾市的2份種質。通過NTSYSPC2.10e軟件對48份材料進行UPGMA聚類分析，其遺傳相似系數介于0.31～0.98之間。由圖2可知，48份種質中親緣關系最近的是47和48，遺傳相似系數為0.98。而親緣關系最遠的是6和18，遺傳相似系數為0.31。在遺傳相似系數為0.66水平處，可把這48份材料分成兩大類。第Ⅰ類包含了46份種質，在遺傳相似系數為0.68的水平上又分為3個亞類。第一亞類包含1、2、12等15份種質（屬群體A）和3、28、25等18份種質（屬群體B），第二亞類包含31、19、24等10份種質（屬群體C），第三亞類包含33、35、37共3份種質（屬群體D）。第Ⅱ類包含了17、18兩份材料（屬群體E）。

2.3 不同籽用美洲南瓜種質資源群體的遺傳多樣性分析

為進一步分析籽用美洲南瓜種質資源遺傳多樣性與其地域來源的關系以及不同區域籽用美洲南瓜種質資源的親緣關系，對這5個群體的I值進行計算。由表3可知，5個群體的I值變化范圍為0.68～1.30，綜合各群體多樣性指數（Na、Ne、I）的計算結果，5個群體的遺傳多樣性由低到高依次為群體E<群體D<群體A群<群體C<群體B，由此可見群體E遺傳多樣性相對較匱乏，群體B的遺傳多樣性相對較為豐富。

2.4 不同籽用美洲南瓜群體間的遺傳一致度和遺傳距離分析

由表4可知，依據5個群體的遺傳距離（GD），其親緣關系由遠到近進行排序：群體E與群體D（0.46）>群體E與群體A（0.37）>群體E與群體C（0.30）>群體D與群體B（0.27）>群體D與群體A（0.26）>群體D與群體C（0.25）=群體E與群體B（0.25）>群體A與群體C（0.18）>群體C與群體B（0.16）>群體A與群體B（0.11）。這表明群體E與群體D的親緣關系最遠，它們之間的遺傳一致度（GI）為0.63，遺傳距離（GD）為0.46;群體A與群體B的種質的親緣關系最近，它們之間的GI為0.90，GD為0.11。

2.5 指紋圖譜的構建

綜合多態性信息含量和基因頻率的數值，再結合基因型數據，挑選出5對引物。由表5可知，將這5對引物按照CMTp141、CMTp26、CMTp120、CMTp265、CMTp41的順序結合可將48份種質材料完全區分開。利用材料在這5對引物中擴增出的譜帶信息構成“0/1”代碼，使得每份種質材料都得到一個獨一無二的編碼，從而構成了這48份材料的數字指紋圖譜，結合片段大小將它們繪制成圖3所示的指紋圖譜。

3 討論與結論

通過對引物的遺傳多樣性分析，結果表明本試驗選用20對引物，擴增出122條條帶，其中，多態性條帶115條，多態率94.26%，高于王洋洋[21]報道的同為SSR分子標記多態性92.36%和劉超[13]報道的SSR分子標記多態性85.89%，說明本試驗所選用的引物具有較高的分辨率，能夠區分親緣關系較近的品種。研究中48份種質間的遺傳相似系數變幅為0.31～0.98，說明這48份籽用美洲南瓜種質間存在較豐富的遺傳多樣性。在聚類分析圖中遺傳相似系數為0.66處，可以將48份種質分為兩大類，第一類包含了來自內蒙古巴彥淖爾市、甘肅、山西及新疆的所有種質材料，而來自內蒙古呼倫貝爾市的種質材料則被單獨聚為一類，由此可見，呼倫貝爾市的種質材料與其他4個地區的種質材料的親緣關系相對較遠。這與對這5個群體間的遺傳距離和遺傳相似系數的分析結果相一致。結合地理位置來看，呼倫貝爾種質被單獨聚為一類可能是由于內蒙古巴彥淖爾市、新疆、山西及甘肅都屬于中國的西北部，而內蒙古呼倫貝爾市更靠近中國的東北部，且相近地區的籽用美洲南瓜種質資源間存在頻繁交流，因此，地理位置相近種質間的親緣關系較為密切。由此可見，種質間的差異受其所處地理位置的影響較大，這與前人的結論較為一致[13，22]。

筆者采用引物組合法對供試材料進行了區分，陳世軍等[23]曾用這種方法為60份黔南野生茶樹構建了指紋圖譜。由于不同引物鑒別能力存在差異，PIC值最高的引物CMTp141僅能區分28個樣品，因此，按照PIC值最高的前4個引物對44份種質資源進行了區分。由于6和7、9和11之間的遺傳相似系數較高，僅有極個別引物能夠將其區分，因此，在符合要求的引物中選取PIC值最高的引物CMTp41對其進行區分。但試驗篩選出的引物的鑒別能力低于陶愛芬等[24]利用88份南瓜種質（包含美洲南瓜、中國南瓜、印度南瓜）分析篩選出的可區分72份種質的引物E5EM8。分析原因，可能是試驗所用材料生態類型較為單一，親緣關系較近，難以通過較少的引物組合對大量種質進行完全區分。后續為了獲取區分能力強的引物，可選擇地理來源更加廣泛、生態類型更加豐富的材料進行試驗。本試驗雖利用5對核心引物將48份種質完全區分，但隨著籽用美洲南瓜的種質資源越來越豐富，這5對引物的鑒別能力也會逐漸下降，需要繼續對來自不同地區籽用美洲南瓜的種質進行指紋圖譜的構建，篩選出更多鑒別能力強的引物，進一步完善籽用美洲南瓜種質的指紋圖譜。

利用篩選出的20對多態性引物對48份種質進行多樣性分析，試驗篩選出的20對多態性較高的引物（PIC≥0.4），可為后續研究提供可參考的引物材料;基于SSR分子標記進行聚類，48份種質被聚為5類，聚類結果與地理來源相一致，即同一地區種質被聚為一類，說明個體間親緣關系與地理來源密切相關，與群體間遺傳距離分析結果一致性較高;本試驗將5對核心引物（CMTp141、CMTp26、CMTp120、CMTp256、CMTp41）進行組合，將48份種質完全區分，進一步完善了籽用美洲南瓜種質的指紋圖譜。

參考文獻

[1] 王豐豐.基于植物學性狀和SCoT標記分析籽用南瓜的遺傳多樣性及南瓜砧木資源的初步篩選[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2018.

[2] 靳娜.籽用南瓜種質資源的評價[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2012.

[3] 李海真，田佳星，張國裕，等.“十三五”我國南瓜遺傳育種研究進展[J].中國蔬菜，2021（9）：16-24.

[4] 郭祿芹，趙世豪，朱華玉，等.167份西瓜種質材料的遺傳多樣性分析[J].中國瓜菜，2018，31（1）：5-11.

[5] 魏照信，陳榮賢，殷曉燕，等.中國籽用南瓜產業現狀及發展趨勢[J].中國蔬菜，2013（9）：10-13.

[6] 鄭揚，張國裕，張帆，等.南瓜育種相關基礎研究進展[J].中國蔬菜，2018（12）：16-23.

[7] 譚行之，崔崇士，屈淑平.南瓜作物分子標記輔助育種研究進展[J].中國瓜菜，2010，23（3）：37-40.

[8] 劉宜生，林德佩，孫小武，等.我國南瓜屬作物產業與科技發展的回顧和展望[J].中國瓜菜，2008，21（6）：4-9.

[9] 張儷文，韓廣軒.植物遺傳多樣性與生態系統功能關系的研究進展[J].植物生態學報，2018，42（10）：977-989.

[10] 孔維政.金柑屬及其近緣屬植物遺傳多樣性與親緣關系分析[D].長沙：湖南農業大學，2020.

[11] 朱華玉，楊路明，宋芃垚，等.西瓜全基因組SSR位點的特征及其在比較遺傳作圖和遺傳多樣性分析中的應用[J].中國瓜菜，2019，32（8）：180-181.

[12] 王艷玲，向成鋼，王長林，等.南瓜屬三個栽培種親緣關系的SSR分析[C]//中國園藝學會南瓜分會籽用南瓜新品種展示及產業發展研討會論文集，2012：73-82.

[13] 劉超.籽用南瓜種質資源遺傳多樣性研究[D].哈爾濱：東北農業大學，2012.

[14] 云天海，鄭道君，謝良商，等.中國南瓜海南農家品種間的遺傳特異性分析和DNA指紋圖譜構建[J].植物遺傳資源學報，2013，14（4）：679-685.

[15] 趙勝杰，關立穎，閻志紅，等.鄭抗系列無籽西瓜品種SSR指紋圖譜的構建[J].中國瓜菜，2012，25（4）：1-4.

[16] 倪維晨，李瑞霞，陶啟威，等.基于SSR標記的地方品種糯性小玉米自交系指紋圖譜構建[J].浙江農業科學，2019，60（6）：911-914.

[17] 李瓊，李金花，常世豪，等.61份高油大豆品種（系）指紋圖譜構建及遺傳多樣性分析[J].河南農業科學，2021，50（9）：53-62.

[18] 秦瑞英，許學，張立平，等.小麥SSR指紋圖譜及品種身份證的構建：基于毛細管電泳分析[J].中國農學通報，2017，33（34）：46-55.

[19] 曾曉珊，彭丹，石媛媛，等.利用SSR標記構建水稻核心親本指紋圖譜[J].作物研究，2016，30（5）：481-486.

[20] ABOUZIED H M，ELDEMERY S M M，BDELLATIF K F.SSR- based genetic diversity assessment in tetraploid and hexaploid wheat populations[J].British Biotechnology Journal，2013，3（3）：390-404.

[21] 王洋洋.美洲南瓜種質資源的遺傳多樣性研究[D].哈爾濱：東北農業大學，2016.

[22] 郭秀霞.不同西葫蘆品種及其親本遺傳多樣性分析[D].太原：山西農業大學，2017.

[23] 陳世軍，張明澤，姚玉仙，等.基于SSR標記的黔南茶樹種質資源DNA指紋圖譜構建[J].植物遺傳資源學報，2017，18（1）：106-111.

[24] 陶愛芬，魏嘉俊，劉星，等.應用SRAP標記繪制88份南瓜屬種質資源DNA指紋圖譜[J].植物遺傳資源學報，2017，18（2）：225-232.