黃皮西葫蘆類胡蘿卜素合成酶基因的鑒定及PSY1和LCYE2克隆分析

唐忠麗，逯曉楠，趙 蕊，劉慶華，李梅蘭，雷逢進，許小勇

(1.山西農業大學 園藝學院，山西省設施蔬菜協同創新中心，山西 太谷 030801；2.山西農業大學 棉花研究所，山西 運城 044000)

西葫蘆(CucurbitapepoL.)別名美洲南瓜，原產北美洲南部，屬于葫蘆科南瓜屬作物，其既可以采摘嫩瓜當作蔬菜食用，又可以采收老瓜用作打籽，在我國南北方廣泛種植。西葫蘆營養豐富，有黃色、綠色、白色、黑綠等多種顏色類型，還具有較高的觀賞價值。色素含量測定結果表明，其主要是由類胡蘿卜素和葉綠素等色素的多樣性積累導致[1]。

類胡蘿卜素是自然界中分布最為廣泛的一大類色素，不僅賦予植物花、果實等器官鮮艷的色彩，還在光合作用、ABA和芳香物質合成中起重要作用[2]。目前，植物類胡蘿卜素合成代謝途徑已基本清晰，共涉及八氫番茄紅素合成酶(Phytoene Synthase，PSY)、八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoene Desaturase，PDS)、番茄紅素環化酶(Lycopene Cyclase，LCY)等11種合成代謝酶[3]。這些結構基因的序列變異或者轉錄水平會直接導致園藝作物中類胡蘿卜素含量改變。例如，Gady等[4]研究發現，番茄中PSY1基因單氨基酸位點變化，導致番茄紅素和β-胡蘿卜素合成緩慢。洪敏等[5]克隆了枇杷中的PSY基因，表明PSY基因可能參與其類胡蘿卜素的合成調控。程潔等[6]從甘薯中克隆到PSY基因，在擬南芥中超表達PSY基因后，葉片中的類胡蘿卜素含量明顯提高。李永平等[7-8]從黃秋葵中克隆到PSY和LCYB基因，揭示了PSY和LCYB基因表達和類胡蘿卜素積累的特性。Pogson等[9]研究發現，擬南芥中編碼LCYE基因LUT2，其lut2突變體表現為葉黃素缺失型，同時β-胡蘿卜素含量大量積累。韓璇等[10]從矮牽牛中克隆到PhLcyB基因，發現其對矮牽牛葉片中類胡蘿卜素的代謝調節有重要作用。此外，一些轉錄因子如MYB、bHLH、ARF以及APRR2、Or等基因，也可以通過調控類胡蘿卜素代謝相關基因的轉錄水平，間接影響類胡蘿卜素的積累[11-14]。總而言之，植物體內主要是通過直接或間接調控類胡蘿卜素合成代謝相關酶基因的表達，從而影響類胡蘿卜素的積累，最終使植物呈現不同色澤。

瓜類類胡蘿卜素積累相關基因克隆研究已取得一定的進展。呂品等[15]從西瓜果實中克隆到ClPSY基因，推測ClPSY基因主要負責果實中類胡蘿卜素的合成。吳川等[16]也從紅肉西瓜中克隆到ClZDS基因。趙軍林等[17]在甜瓜中克隆到八氫番茄紅素脫氫酶CmPDS基因，且發現CmPDS基因隨果實的發育成熟，表達量呈現先升后降的趨勢。盡管如此，但仍有大量類胡蘿卜素合成代謝相關基因未被克隆報道，尤其是關于西葫蘆果皮顏色積累的分子機制、黃皮決定基因等依然未知。

本研究通過對類胡蘿卜素合成代謝酶基因家族的鑒定、基因表達定量分析等，篩選并克隆西葫蘆類胡蘿卜素合成代謝相關酶基因，比較其序列差異等，旨在為下一步揭示黃皮西葫蘆色素形成的分子機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用白皮、黃皮西葫蘆材料均為高代自交系，于2020年春種植于山西農業大學園藝試驗站大棚內，于結果期分別選取2種材料授粉后0，2，6，10，20 d的果實果皮，迅速放于液氮中冷凍，于-80 ℃冰箱備用。

1.2 西葫蘆類胡蘿卜素合成代謝相關酶基因的鑒定及表達分析

在葫蘆科基因組數據庫GuGenDB中(http：//cucurbitgenomics.org/)[18]下載已經注釋的西葫蘆類胡蘿卜素合成代謝相關基因序列信息，進一步使用pfam數據庫(http：//pfam.xfam.org/)[19]進行結構域篩選確認。利用公開發表的Sweet REBA和Lady Godiva這2種不同顏色果皮材料不同發育時期果實果肉的轉錄組數據[20]，分析類胡蘿卜素合成基因在不同發育時期果肉中的動態表達。根據基因表達量FPKM值[21]來呈現基因表達水平，并利用TBtools軟件[22]繪制基因表達熱圖。

1.3 qRT-PCR驗證

樣品總RNA的提取使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根，DP419)，使用2 × inNova Taq SYBR?Green qPCR Mix(With ROX)試劑盒(innovagene，SQ121-01)進行PSY1和LCYE2基因qRT-PCR定量分析。試驗參照西葫蘆基因組序列(http：//cucurbitgenomics.org/)，利用NCBI網站上的Primer-BLAST工具設計PSY1和LCYE2基因特異性定量引物(表1)。以西葫蘆肌動蛋白Actin基因(GenBank登錄號MH211008)用作內參基因，使用2-ΔΔCt法對試驗結果進行歸一化數據處理，統計相對表達量。

表1 引物名稱及其序列Tab.1 Primer name and sequence

1.4 基因克隆及序列分析

樣品總RNA的提取使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根，DP419)，cDNA的合成使用1stStrand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒(innovagene，AR111-02)，具體操作步驟根據說明書進行。以cDNA為模板進行PCR擴增，獲得目的片段(引物序列見表1)，并連接到pMD18-T載體上，挑取單菌落篩選、鑒定，并送至上海生工生物有限公司測序。利用SnapGene進行基因序列比對分析。

1.5 系統發育樹分析

利用MEGA 7.0[23]軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining methed，NJ)構建系統發育樹，其中，校驗參數Bootstrap值設置為1 000次，遺傳距離計算模型設置為P-distance，空位缺失數據的處理設置為Pairwise deletion。

2 結果與分析

2.1 類胡蘿卜素代謝酶基因的鑒定

通過對西葫蘆數據庫比對及pfam結構域篩選，最終在西葫蘆基因組中共鑒定出48個類胡蘿卜素代謝酶基因，每類酶基因平均有3.46個拷貝。其中，NCED基因8個，ZEP基因6個，GGPPS、PSY和CCD基因各5個，LCYB、BCH和ECH基因各3個，PDS、CRTISO、LCYE以及VDE基因各2個，ZDS和NXS基因均只有1個(表2)。這48個基因中，除ZEP1和LCYB3基因僅能定位于未組裝的LG00染色體外，其余46個基因均分布在除了LG17和LG18之外的18條染色體上。大多數基因存在于基因密度較高的區域，其中，LG01和LG14染色體上基因數目最多，分別有6個；而LG02、LG06、LG08、LG09和LG20染色體上基因數目最少，分別只有1個。這些基因CDS的平均長度為1 395.75 bp，其中最長的是位于Cp4.1LG05染色體上的ZEP4(Cp4.1LG05g11360.1)，全長1 944 bp；而最短的是位于Cp4.1LG03上的NXS(Cp4.1LG03g06210.1)，全長693 bp。

表2 西葫蘆類胡蘿卜素代謝關鍵基因參考信息Tab.2 The information of key genes for carotenoid metabolism in zucchini

表2(續)

2.2 不同發育時期類胡蘿卜素代謝基因表達模式分析

利用公開發表的Sweet REBA和Lady Godiva這2個材料不同發育時期果肉轉錄組數據，分析上述48個類胡蘿卜素代謝基因表達模式，結果表明(圖1)，GGPPS1、PDS、PSY2、LCYB2、LCYE2、BCH3、ECH3等基因在果實發育時期持續高水平表達，大多數CCD和NCED等基因在整個時期保持較低的表達水平；而PSY1、LCYE2等基因在2個材料間的表達水平動態變化差異相對較大，可能是由于2個材料中類胡蘿卜素含量差異較大，在果實類胡蘿卜素積累過程中起著關鍵性作用，是重點關注的對象。

R/LG表示2個西葫蘆材料Sweet REBA/Lady Godiva；5/10/15/20/40分別表示授粉后5，10，15，20，40 d的果實。R/LG represents two zucchini materials Sweet REBA/Lady Godiva；5/10/15/20/40 respectively represent the fruits at 5，10，15，20，40 d after pollination.

2.3 候選基因PSY1和LCYE2的qRT-PCR分析

進一步對PSY1(Cp4.1LG13g05570.1)、LCYE2(Cp4.1LG11g11790.1)2個關鍵酶基因在白皮和黃皮西葫蘆果皮不同發育時期的qRT-PCR分析表明(圖2)，PSY1基因隨著授粉后果實發育在白皮西葫蘆中的表達水平總體呈逐漸降低趨勢，而在黃皮西葫蘆中總體呈現波動式上升趨勢，尤其是在10 d表達量差異達到最大值，約為白皮西葫蘆同期的10倍(圖2-A)。LCYE2基因在白皮西葫蘆中的表達水平一直處于相對較低水平，且逐漸降低，而在黃皮西葫蘆中的表達水平逐漸升高，且在6 d及以后差異不斷放大，遠高于白皮西葫蘆，在20 d時黃皮西葫蘆中的LCYE2基因表達量已達到白皮西葫蘆的40倍(圖2-B)。由此可見，隨著果實發育除PSY1基因0 d和LCYE2基因2 d外，其他時間點基因的表達水平都呈現出黃皮西葫蘆高于白皮西葫蘆的趨勢。這2個基因在整個果實發育時期，尤其在10 d后的果實顯著轉色時期起著決定性作用。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different lowercase indicate significant difference(P<0.05).

2.4PSY1和LCYE2基因的克隆及序列分析

分別提取白皮、黃皮西葫蘆的總RNA，合成cDNA一鏈，并以此為模板，擴增西葫蘆的PSY1、LCYE2基因，分別得到約1 200 bp(圖3-A)和1 800 bp(圖3-B)的條帶，與預期結果基本一致。隨后的克隆測序結果發現，西葫蘆PSY1、LCYE2基因分別編碼1 263，1 602 bp的開放閱讀框。與已公布的西葫蘆基因組PSY1基因由6個外顯子和5個內含子組成不一致的是，所克隆的白皮西葫蘆PSY1(W)和黃皮西葫蘆PSY1(Y)基因編碼區序列比參考序列(1 212 bp)多出的51 bp是原本注釋為內含子的一段片段(圖4-A)。與GenBank已報道的(登錄號：XM_023695146.1)序列一致，編碼一個完整的蛋白質，比預測蛋白質序列多出17個氨基酸，不改變其余部分蛋白質編碼序列。將西葫蘆PSY1基因與其他瓜類的PSY1同源基因序列進行比對，結果顯示，同源性高達96%，且在其他瓜類的PSY1基因中發現均含有51 bp的外顯子區域(圖4-B)。

PSY1(W)來自白皮西葫蘆克隆，PSY1(Y)來自黃皮西葫蘆克隆； LCYE2(W)來自白皮西葫蘆克隆，LCYE2(Y)來自黃皮西葫蘆克隆。M.DNA Marker DL2000。PSY1 (W)is cloned from white peeled zucchini， PSY1 (Y)is cloned from yellow peeled zucchini；LCYE2(W)is cloned from white peeled zucchini，LCYE2(Y)is cloned from yellow peeled zucchini.M.DNA Marker DL2000.

A.序列比對，Ref PSY1為參考序列，PSY1(W)為白皮西葫蘆PSY1，PSY1(Y)為黃皮西葫蘆PSY1；B.不同瓜類PSY1基因序列比對。A.Sequence alignment，Ref PSY1 is the reference sequence，PSY1 (W)is white peeled zucchini PSY1， PSY1 (Y)is yellow peeled zucchini PSY1；B.Sequence alignment of PSY1 gene in different cucurbits.

2.5 系統進化樹構建

進一步應用MEGA 7.0軟件構建PSY1基因與其他物種的PSY蛋白之間的系統進化樹，結果表明(圖5)，西葫蘆與中國南瓜的親緣關系最近，相似度高達98.80%。另一個LCYE2基因由11個外顯子和10個內含子組成，外顯子大小為103～300 bp不等，測序結果與基因組序列結構一致，無點突變和氨基酸差異。

圖5 西葫蘆PSY1基因與其植物PSY基因的系統進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of PSY1 gene in zucchini and PSY genes in other plants

3 結論與討論

果皮顏色是西葫蘆重要的農藝性狀之一，其類胡蘿卜素含量與西葫蘆的皮色密切相關。而PSY和LYCE基因是類胡蘿卜素合成代謝的關鍵酶基因之一。郭新倫[24]研究發現，PSY基因在牛奶子(ElaeagnusumbellateThunb.)果實成熟期間表達量持續升高，除番茄紅素外的其他類胡蘿卜素含量逐漸下降或消失，說明牛奶子果實中番茄紅素的積累是類胡蘿卜素代謝途徑各基因協同作用的結果。Guo等[25]研究發現，紅肉西瓜中PSY1的表達與番茄紅素積累呈正相關。Obrero等[26]對白皮、綠皮和黃皮西葫蘆栽培品種比較觀測發現，果皮和果肉顏色都與類胡蘿卜素積累相關，PSY基因在橙黃皮西葫蘆中表達量高于白皮和綠皮西葫蘆；通過qRT-PCR確定番茄紅素ε環化酶LCYe基因的轉錄水平與果皮果肉中類胡蘿卜素的積累高度相關，且LCYE基因在橙黃皮和綠皮西葫蘆中表達量高于白皮西葫蘆，而在白皮西葫蘆中幾乎不表達。李靜文等[27]研究發現，在芹菜中AgLCYE基因的表達量隨著生長期的增加逐漸升高，葉柄中逐漸降低。余磊等[28]從三紅蜜柚中克隆到PSY、PDS、ZDS、LCYB基因，發現這些基因在果實生長發育過程中呈現增長或先增后降的趨勢，且在成熟期表達量最高。與Obrero等[26]的研究結果基本一致，本研究發現，PSY1基因在白皮西葫蘆中的表達量逐漸降低，而黃皮西葫蘆中的表達量呈現波動式上升趨勢，在授粉10 d時表達量最高，且黃皮西葫蘆中的表達量高于白皮西葫蘆同期。LCYE2基因在白皮西葫蘆中的表達一直處于較低水平且逐漸降低，而在黃皮西葫蘆中隨著果實發育逐漸升高，預示著PSY1和LCYE2基因在黃皮西葫蘆色素積累過程中起著重要作用。

已經公開的基因組序列為研究者進行基因定位、克隆等提供了很多便利，但所預測序列可能有所偏差。本研究發現，從2種不同果色西葫蘆中克隆到的PSY1基因均與已經報道GenBank(登錄號：XM_023695146.1)預測序列基本一致，但比參考基因組預測的CDS序列多了一個51 bp的外顯子。擴大比對群體，將西葫蘆的PSY1基因與其他瓜類同源基因進行比對發現，其余瓜類也都含有51 bp的外顯子區域，因此，西葫蘆數據庫中所預測的PSY1基因將這51 bp視為含子而忽略。因此，有時候生物信息學預測的CDS序列仍需要通過實際試驗來驗證。

綜上所述，本研究從西葫蘆參考基因組中鑒定了48個類胡蘿卜素合成代謝相關酶基因，進一步通過表達定量等篩選并克隆出PSY1、LCYE2等2個關鍵基因，下一步將進行遺傳轉化等研究揭示基因功能，為后期進行黃皮西葫蘆類胡蘿卜素積累的分子機制的解析奠定基礎。