以糖蜜酸水解液為原料制備PHB的工藝優化

韓卓濤，陳育林，文小波，盧悅

（西華大學食品與生物工程學院,四川成都 610039）

全球每年大約生產3500萬t塑料垃圾，其中大約只有7%經回收處理，剩余大部分被堆積于垃圾填埋場自然降解[1]。傳統塑料降解緩慢，且在降解過程中會產生微塑料，不僅影響環境，更會危害人類健康[2]。這些問題推動了對可降解的、安全的傳統塑料替代品的需求。聚羥基丁酸酯（Polyhydroxybutyrate,PHB）是最早發現的聚羥基脂肪酸酯，由于具有可生物降解性、可再生性、生物相容性和環境友好性等優點，可作為傳統塑料的潛在替代品[3]。

PHB主要依賴于微生物發酵生產，可由許多細菌和古細菌在氮或磷受限時，作為碳源和能量物質被合成并積累于細胞內，由于較高的原料成本限制了其大規模生產和應用，因此目前PHB主要用于醫學領域[4?5]。甘蔗糖蜜是制糖工業的主要副產物，含有豐富的多糖和還原糖，每生產1 t原糖便會有0.38 t糖蜜產出[6]。中國作為世界上最大的糖產區之一，糖蜜的年生產量可達400萬t[7]。李曼瑋[8]通過對甘蔗糖蜜的預處理，使其轉化為易于利用的碳源，比如葡萄糖、果糖等，供微生物用于PHB的生產。除可發酵單糖外，乙酰丙酸（Levulinic acid,LA）也可用于培養殺蟲貪銅菌（Cupriavidus necator,C.necator），并制備PHB[9?10]。作為具有較高應用價值綠色平臺化合物的LA，可由多種廢棄生物質經酸水解產生，是一種廉價、易得的發酵原料[11]。通常，含糖生物質為原料制備LA采用稀H2SO4和稀HCl的均相催化處理水解[12]。在此過程中，LA產率往往受多個條件因素的影響，對于多變量問題，采用響應面法可以簡單準確地找出最優的一組水解條件因素[13]。

本試驗以甘蔗糖蜜為原料，以H2SO4為催化劑，在單因素的基礎上通過響應面法對LA的制備條件進行優化，以期獲得更高的LA產率。同時利用甘蔗糖蜜水解液培養C.necator生產PHB，以期為后續研究提供一定的數據參考。

1 材料和方法

1.1 材料與培養基

1.1.1 試劑

市售糖蜜；LA，分析純，上海皓鴻生物醫藥科技有限公司；濃硫酸、甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、5-羥甲基糠醛（5-Hydroxymethylfurfural,5-HMF）、糠醛、氯仿，分析純，甲醇，色譜純，成都科隆化學品有限公司；PHB，上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 培養基

YPM液體培養基、礦物質溶液培養基按照Mohan等[1]試驗方法進行配制，甘蔗糖蜜水解液培養基：在礦物質溶液培養基中添加甘蔗糖蜜水解液使培養基中LA初始濃度為5 g/L。甘蔗糖蜜水解液在響應面法獲得的最佳條件下制得，經8000 r/min離心5 min去除雜質。上述培養基使用2 mol/L NaOH調節pH為7.0后121℃下滅菌20 min。

1.1.3 菌株

殺蟲貪銅菌（CGMCC 1.7093），購于中國普通微生物菌種管理保藏中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘蔗糖蜜酸水解制備LA的單因素試驗

選擇液固比、反應溫度和反應時間進行單因素試驗，考察其對LA產率的影響。各因素的梯度設置：液固比為1、2、3、4、5 mL/g；反應溫度為60、100、140、180、220℃；反應時間為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。

1.2.2 響應面優化試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，利用Design-Expert 8.0.6軟件，以LA產率（%）為響應值，采用Box-Behnken中心組合設計3因素3水平的響應面試驗，確定甘蔗糖蜜酸水解制備LA的最佳條件。響應面因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平

1.2.3 甘蔗糖蜜酸水解處理

取一定量的甘蔗糖蜜和0.67 mol/L的H2SO4溶液[14]于反應釜中充分混勻，將反應釜放入強對流烘箱（Memmert UF260）中加熱，在不同溫度下反應到預定時間后迅速水冷至室溫。將產物過濾獲得水解液和殘渣。水解液經稀釋適當倍數后通過高效液相色譜法（HPLC，島津LC16，配備SPD-16紫外可見雙波長檢測器）測定其中LA含量，并計算LA產率。

1.2.4 LA含量測定和產率計算

參考陳小敏等[15]的試驗方法測定水解液中LA含量，LA產率（%）按照公式（1）來計算。

式中：ρ1為通過HPLC測得的LA濃度；N為稀釋倍數；V為水解液體積；M為糖蜜質量。

1.2.5 水解液中小分子酸、5-HMF和糠醛含量測定

參照盧倩文等[16?17]的試驗方法分別測定水解液中的甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、5-HMF和糠醛的含量。

1.2.6 甘蔗糖蜜水解液培養C.necator產PHB試驗

在YPM固體培養基上挑取單個菌落接種于裝有YPM液體培養基試管中，于30℃150 r/min培養24 h。8000 r/min離心5 min收集菌體，棄去發酵上清液，用0.85%的NaCl溶液復懸，按照5%接種量接種于糖蜜水解液培養基中，250 mL錐形瓶裝樣量100 mL，于30℃150 r/min培養48 h。通過干重法測得生物量。培養結束時收集菌體烘干后測定PHB含量。

1.2.7C.necator菌體中PHB含量測定

參照Lu等[18]試驗方法進行菌體中PHB的提取和測定，按照公式（2）計算菌體中PHB含量（%）。

式中：m為測得的PHB質量；M2為菌體質量。

1.3 數據處理

每組試驗重復3次，采用IBM SPSS statistics 20軟件對試驗數據進行方差分析和多重比較，采用Origin 2018軟件進行繪圖，采用Microsoft Excel 2019軟件進行數據計算。

2 結果與分析

2.1 單因素對LA產率的影響

以蔗糖為主要成分的糖蜜酸水解制備LA一般需要經歷3個過程[19]，如圖1所示，在高溫高壓酸性條件下，蔗糖首先水解生成葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖進一步脫水形成5-HMF，5-HMF經水合反應最終形成LA和甲酸。在反應過程中，溫度的升高和壓力的增大會提高單糖生成5-HMF以及5-HMF生成LA的反應速率，但過高的溫度會使單糖和5-HMF發生碎裂反應生成更多的副產物[20]。反應體系中原料的占比和水解時間也影響著反應的進程，因此以甘蔗糖蜜作為LA生產原料時，有必要研究液固比、反應溫度和反應時間對LA產率的影響。

圖1 蔗糖酸催化轉化為LA的反應路線

液固比、反應溫度和反應時間對LA產率影響如圖2所示。由圖2（a）可知，隨著反應體系中糖蜜含量的降低，LA產率呈現先升高后下降的趨勢，當液固比為2 mL/g時，LA產率最高，為34.05%。當反應體系中糖蜜含量較低時，H2SO4不能與糖蜜更好地接觸，水解效率降低，但糖蜜含量過高時會破壞反應體系的均勻性，溶液呈粘稠狀，水解過程中糖蜜易碳化從而使得LA產率下降[21]；因此，選擇液固比為2 mL/g左右較為適宜。

反應溫度對LA產率的影響如圖2（b）所示，在140℃時LA產率最高，為36.45%。隨著反應溫度的提高，LA產率下降，在220℃降低至21.31%。氫離子電離速度會隨著溫度的升高而加快，從而提高水解速度，但高溫會促使糖蜜生成更多的焦炭物質[19]，從而降低LA產率，同時高溫也會加重H2SO4對容器的腐蝕程度[22?23]；因此，水解溫度選擇140℃左右為宜。

圖2 液固比、反應溫度和反應時間對LA產率的影響

反應時間對LA產率的影響如圖2（c）所示，反應的前1.5 h內LA產率明顯提高并在1.5 h達到最大，為39.77%。隨著反應時間的進一步延長，LA產率下降并維持在一定水平，因此反應時間選擇為1.5 h左右。

2.2 響應面優化試驗的結果與驗證

2.2.1 響應面試驗結果的優化

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken響應面設計，以液固比（A）、反應溫度（B）和反應時間（C）作為自變量，以液固比2 mL/g，反應溫度140℃，反應時間1.5 h為響應面分析中心點，進行3因素3水平的響應面試驗（表2）。17次試驗表明，液固比越小、反應時間越短，LA產率越高，最高可達到46.27%，相反，高液固比和較長反應時間導致LA產率最高僅為24.91%。高溫和低溫對LA的產率均有負面影響，100℃下LA最高產率僅為25.15%，180℃下LA最高產率為35.03%。采用Design-Expert 8.0.6軟件對表中試驗數據進行多項式回歸分析建立二次響應回歸方程，擬合得到LA響應回歸方程：

表2 甘蔗糖蜜酸水解制備LA Box-Behnken試驗設計與結果

對模型進行顯著性和方差分析，由表3可知回歸方程決定系數R2=0.9026，R2Adj=0.7774，F值為7.21，回歸模型P＜0.01，達到極顯著水平，說明該方程顯著回歸，這意味著液固比、反應溫度和反應時間的聯合效應對LA產率的變化有顯著影響。模型失擬項P>0.05，差異不顯著，表明模型擬合程度良好且試驗誤差較小，可以用于分析和檢測。各因素交互作用響應曲面圖如圖3所示。圖3（a）表明，當溫度為140℃時，LA產率達到最大，這意味著溫度進一步提高到140℃以上時不會導致LA產率按比例增加。圖3（b）曲面最陡，說明液固比和反應時間的交互作用對LA產率的影響最為顯著。圖3（b）和圖3（c）相應曲線上沒有顯示出最大點和最小點，但該設計的范圍已經可以為分析提供足夠的有效信息，另一方面，不需要在更高液固比和更高反應時間下試驗，因為LA產率極低。

圖3 各因素相互作用對LA產率響應值的響應面圖

表3 甘蔗糖蜜酸水解制備LA響應面設計回歸模型方差分析

2.2.2 響應面模型的驗證

根據以上優化結果，對模型預測值進行驗證，根據實際情況將預測條件優化為：液固比1.24 mL/g、反應溫度為146℃、反應時間為1 h，此條件下LA的產率為44.09%，與預測值（43.26%）接近，表明優化模型合理可靠。未優化時LA產率為17.39%，優化后LA產率大大提高。此外，本次優化后LA的產率優于宋道君等[21]報道使用硫酸催化甘蔗糖蜜制備LA的產率（30.11%）。

2.3 水解液成分的種類和含量

已有研究表明，過高濃度的小分子酸會對C.necator產生較強的生理毒性，抑制細胞生長，因此在發酵過程中應維持LA≤5 g/L、甲酸≤2 g/L、乙酸≤1 g/L、丙酸和丁酸≤0.5 g/L[9,24]。呋喃類化合物5-HMF和糠醛會導致C.necator的延滯期延長，但其在發酵液中濃度小于5 mmol/L時，C.necator可以通過自身的代謝機制對其進行有效脫毒[1]。對水解液中含有的幾種小分子酸、5-HMF和糠醛含量進行測定，結果表明（表4），LA濃度可達196.20±3.32 g/L，甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸和5-HMF的濃度分別為46.23±4.16、37.84±3.47、24.86±2.06、2.02±0.06和25.11±0.57 g/L，糠醛的濃度較低，僅有0.43±0.06 g/L。水解液中LA等成分含量遠遠大于C.necator的耐受范圍，進行批次發酵試驗時，對水解液應進行適當稀釋以降低其對C.necator的抑制作用。

表4 糖蜜水解液成分的種類和含量

2.4 糖蜜水解液培養C.necator

本研究通過富含LA的甘蔗糖蜜水解液培養C.necator驗證其生產PHB的可行性。C.necator利用LA合成PHB的代謝網絡見圖4。LA以自由擴散的形式進入C.necator細胞后被?；o酶A合成酶激活生成丙酰輔酶A和乙酰輔酶A[25?26]，其中丙酰輔酶A可以通過2-甲基檸檬酸循環生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A可進入三羧酸循環用于細胞生長。兩分子乙酰輔酶A在β-酮硫酶作用下縮合生成乙酰乙酰輔酶A，后者在NADPH依賴性乙酰乙酰輔酶A還原酶的作用下生成3-羥基丁酸酰基輔酶A，最后在PHA聚合酶的作用下縮合形成不斷延長的聚合物骨架[25?28]。

圖4 C.necator利用LA合成PHB的代謝網絡

和其他小分子酸類似，LA可以酸化細菌的細胞質并抑制血紅素合成從而影響細菌的新陳代謝，雖然可以通過逐步提高培養基中LA的濃度來增強C.necator對其耐受程度，但野生型C.necator只能在最高5 g/L LA下正常生長[9]。為了避免高濃度LA對C.necator產生強烈的抑制作用以及低濃度LA下碳源供應不足的情況，配制LA濃度為5 g/L的糖蜜水解液培養基培養C.necator進行PHB的生產試驗。試驗表明（圖5），前12 hC.necator處于對LA的適應階段，生長緩慢，可能5 g/L LA仍然會對其產生一定的生理毒性。隨著LA濃度的降低以及生物量的緩慢增長，C.necator對LA的耐受能力提高并在12～36 h期間快速生長。36 h以后由于LA濃度較低，C.necator可利用的碳源不足，生長減緩。根據細胞質量計算公式C4.08H6.87N1.0O1.89可以推測氮約占C.necator細胞質量的14%[18]。本研究以2 g/L (NH4)2SO4作為細胞生長的唯一氮源，因此可以預測當氮源完全消耗后培養基中會形成約3 g/L生物量。培養48 h生物量達到2.99 g/L，與預測值接近，因此推測此時發酵液中僅殘留少量未被利用的(NH4)2SO4。當碳源充足的培養基中存在氮時，C.necator主要進行菌體生長，在氮匱乏時C.necator才會在細胞內合成大量PHB[29?30]。經測定，培養48 h菌體中PHB含量占細胞干重的14.85%，發酵后期碳源的不足可能導致最終菌體中PHB含量較低，但通過本次試驗足以說明富含LA的糖蜜水解液可以用于PHB的生產。

圖5 糖蜜水解液中C.necator生長和LA消耗曲線

3 結論

本文以糖蜜為原料酸水解制備LA，通過單因素和響應面優化試驗，獲得最佳條件為液固比1.24 mL/g、反應溫度146℃、反應時間1 h，水解液中LA的質量濃度為196.20±3.32 g/L，糖蜜轉化為LA的產率為44.09%。水解液的其他成分質量濃度為：甲酸46.23±4.16 g/L、乙酸37.84±3.47 g/L、丙酸24.86±2.06 g/L、正丁酸2.02±0.06 g/L、5-HMF 25.11±0.57 g/L、糠醛0.43±0.06 g/L。以稀釋后的糖蜜酸水解液為原料，培養C.necator48 h后，生物量達到2.99 g/L，菌體中PHB含量占細胞干重的14.85%。本文建立的二次多項式模型回歸性顯著且擬合程度良好，通過本次優化明顯提高了糖蜜酸水解制備LA的產率，并驗證了利用富含LA的糖蜜水解液用于生產PHB的可行性，為降低PHB生產成本提供了新的思路。