槲皮素對Aβ25-35誘導的PC12細胞線粒體途徑凋亡的雌激素樣神經保護作用

趙雨薇，戴月英，甄艷杰，李 煒，沈麗霞

(河北北方學院藥學系，河北省神經藥理學重點實驗室，河北 張家口 075000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，以漸進性記憶缺失和行為異常為主要臨床表現的中樞神經系統退行性疾病[1]。引起AD的機制尚不明確，主要存在諸如氧化應激、線粒體損傷、Aβ毒性等假說，Aβ沉積、神經炎癥的發生和氧化應激等均會引起線粒體損傷[2]，線粒體因其能控制細胞的能量狀態和細胞凋亡，被認為在調節衰老和與年齡相關的神經元變性中發揮中央細胞器作用[3]。線粒體電子因在衰老組織中的運輸效率較低，損害ATP的合成從而導致氧化劑產生增加[4]，這種變化可能引起細胞凋亡而致大腦衰老，造成認知功能喪失[5]。以往的研究表明[6]，Aβ誘導破壞膜的性質和改變線粒體的動力學，引發線粒體膜電位的崩潰，誘導釋放因子透過線粒體膜于細胞質中，發生凋亡級聯反應，促進AD的發生和發展[7]。

槲皮素(quercetin，Que)結構與雌二醇類似，是一種天然的植物雌激素，在改善心血管疾病和神經系統方面有一定作用[8]。課題組前期研究表明，Que可通過雌激素受體介導信號通路的激活，減少Aβ25-35毒性損傷的PC12細胞凋亡[9]。根據往期實驗結果，本實驗繼續采用20 μmol·L-1Aβ25-35毒性損傷的PC12細胞作為AD體外模型，17β-雌二醇(17β-estradiol，17β-E2)與50 μmol·L-1金雀異黃素(genistein，Gen)作為陽性對照，進一步探討Que通過雌激素受體介導線粒體途徑的機制而抑制Aβ25-35毒性損傷引起的細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 PC12細胞，中國科學院昆明細胞庫。

1.1.2藥物與試劑 槲皮素(100081-201610)和金雀異黃素(111704-201703)購于中國藥品生物制品檢定研究所；Aβ25-35(Y0044)購于北京博奧森；Rhodamine 123(C2007)購于碧云天生物技術；Bradford蛋白濃度測定試劑盒(BCA法)(BL521A)購于Biosharp公司；琥珀酸脫氫酶(SDH)測試盒(A022)和超微量Na+,K+-ATP酶測試盒(A070-2)購于南京建成生物工程研究所；CyTM3-conjugated Affini Pure Goat Anti-Mouse IgG(101887)購于Jackson Immuno Research 公司；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗 IgG(H+L)(4103945)購于 Novus Biologicals 公司；β-action(SC47778)購于聯科生物公司；17β-雌二醇(ab120657)、雌激素受體完全拮抗劑ICI182,780(ab120131)、anti-Estrogen Receptor alpha antibody(ab32063)、anti-Estrogen Receptor beta antibody(ab3576)、Anti-Bcl-2 antibody(ab59348)、Anti-Bax antibody(ab182733)、Anti-active caspase-3 antibody(ab49822)、重組Anti-Cytochrome C antibody(ab133504)購于美國Abcam公司；

1.1.3儀器 CO2培養箱(Thermo 公司)；超速冷凍離心機(Sigma公司)；激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS公司)；熒光倒置顯微鏡(Nikon公司)；體視學顯微鏡(Leica公司)；多功能酶標儀(Tecan公司)；化學發光凝膠成像系統(Protein Simple公司)。

1.2 方法

1.2.1線粒體膜電位的測定 細胞以每孔1×104的密度接種于培養皿24 h后。實驗分組為Control組、Aβ25-35毒性損傷組、Aβ25-35與17β-E2、Gen、Que(40、60、80 μmol·L-1)分別共孵育組，給藥24 h后，加入37 ℃預溫育的Rhodamine 123染色液1 mL，作用20 min后；DAPI復染，使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察拍照。

1.2.2SDH的測定 細胞以1×108L-1密度將接種于6孔細胞培養板中，實驗分組為Control組、Aβ25-35毒性損傷組、Aβ25-35與17β-E2、Gen、Que(40、60、80 μmol·L-1)分別共孵育組和雌激素受體完全拮抗毒性損傷組。按說明書提取分離各組線粒體，獲取各組線粒體懸液，按照SDH測試盒測定線粒體SDH活力。

1.2.3Na+,K+-ATP 酶活力的測定 細胞以1×108L-1密度將接種于6孔細胞培養板中，實驗分組同“1.2.2”，按照Na+,K+-ATP酶測試盒測定線粒體Na+,K+-ATP酶活力。

1.2.4Western blot檢測相關蛋白 細胞分組同“1.2.2”，提取各組細胞總蛋白，BCA法定量各組蛋白，制膠，上樣，BIO-RAD凝膠電泳和轉膜，室溫封閉液封閉2 h后，加入一抗 β-actin(1 ∶500)、雌激素受體 α / β(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶2 000)、caspase-3(1 ∶600)、Cytochrome C(1 ∶5 000)，4 ℃孵育過夜。TBST進行清洗3次(每次10 min)。室溫孵育二抗(Goat anti-mouse IgG/HRP，1 ∶4 000)2 h。TBST 進行清洗3次(每次10 min)，使用ECL曝光顯影后，分析各組條帶灰度值。

2 結果

2.1 Que 對線粒體膜電位的影響與正常對照組相比，毒性損傷組熒光較強，差異具有統計學意義(P<0.01)；與毒性損傷組相比，Aβ25-35+17β-E2、Aβ25-35+Gen、Aβ25-35+Que(60 μmol·L-1)組熒光強度均明顯降低(P<0.01)(Fig 1A，B)。表明Que 可改善Aβ25-35毒性損傷造成的PC12細胞內線粒體膜電位降低，作用與陽性藥17β-E2和Gen效果相似。

Fig 1 Effect of Que and Aβ25-35 on mitochondrial membrane potential in PC12 cells(×600)A:Fluorescence of mitochondrial membrane potential of PC12 cells; B: Quantification of the mitochondrial membrane potential mean fluorescent n=4). **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs Aβ25-35

2.2 Que對毒性損傷的PC12細胞線粒體影響

2.2.1Que對線粒體SDH酶活力的影響 如Fig 2A中所示，與正常組相比，Aβ25-35毒性損傷組 SDH 活力水平明顯減少(P<0.01)。低中高劑量濃度的 Que(40、60和80 μmol·L-1)和 Aβ25-35共孵育24 h后的細胞 SDH 活力水平與毒性損傷組相比明顯增加(P<0.01)。提示Que可提高PC12損傷細胞的線粒體琥珀酸脫氫酶活力，效果與17β-E2和Gen相似。

Fig 2 Effect of Que on SDH activity on PC12 n=4)A: Effect of Que on PC12 cell SDH activity injured by Aβ25-35 toxicity. B: Effect of Que on PC12 cell SDH activity pretreated with ICI182,780. *P<0.05,**P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs Aβ25-35; △△P<0.01 vs Aβ25-35+Que(60 μmol·L-1)

含有ICI182,780抑制劑預處理組中，Aβ25-35+ICI182,780+Que組細胞的線粒體琥珀酸脫氫酶活力與Aβ25-35+Que相比明顯被抑制(P<0.01)(Fig 2B)，表明在Que提高PC12損傷細胞的線粒體 SDH 酶活力過程中，具有ER受體通路的參與。

2.2.2Que對線粒體Na+,K+-ATP酶活力影響 如Fig 3A中所示，Aβ25-35+Que(40、60和80 μmol·L-1)組Na+,K+-ATP活力分別為(1.38±0.03)U·mgprot、(1.71±0.04)U·mgprot和(1.28±0.05)U·mgprot，與毒性損傷組相比差異有統計學意義(P<0.01)。結果表明，Que 可提高毒性損傷的PC12細胞內線粒體Na+,K+-ATP酶活力，效果與17β-E2和Gen相似。

Fig 3 Effect of Que on Na+,K+-ATPase activity on PC12 n=4)A: Effect of Que on PC12 cell Na+,K+-ATPase activity injured by Aβ25-35 toxicity. B: Effect of Que on PC12 cell Na+,K+-ATPase activity pretreated with ICI182,780. **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs Aβ25-35; △△P<0.01 vs Aβ25-35+Que(60 μmol·L-1)

含有ICI182,780抑制劑預處理組中，Aβ25-35+ICI182,780+Que 組細胞線粒體的Na+，K+-ATP 酶活力與Aβ25-35+Que組相比被明顯抑制(P<0.01)(Fig 3B)，表明ER受體通路的阻斷影響了Que 對 Na+,K+-ATP酶活力的保護。

2.3 Western blot 檢測 ERα、ERβ 以及 Bcl-2、Bax、active-caspase-3 與 Cytochrome C蛋白表達與正常對照組相比，毒性損傷組明顯下調ERα表達(P<0.01)，陽性藥(17β-E2、Gen)和Que分別與Aβ25-35共同孵育后，均明顯升高了ERα表達(P<0.01)，而毒性損傷組和藥物(17β-E2、Gen和Que)+Aβ25-35共同孵育后ERβ蛋白組間表達差異無顯著性(P>0.05)(Fig 4A，B，C)。藥物(17β-E2、Gen和Que)+Aβ25-35組與毒性損傷組相比，上調了Bcl-2表達(P<0.05)(Fig 5A，B)，下調Bax、active-caspase-3 與Cytochrome C蛋白的表達(P<0.05)(Fig 5A、C，Fig 5A、E，Fig 5A、F)，提高了Bcl-2 / Bax蛋白表達比率(P<0.01)(Fig 5A、D)。使用ICI182,780抑制劑進行干預進一步探討Que神經保護作用機制。結果發現，Aβ25-35+Que(60 μmol·L-1)組與毒性損傷組相比，Bcl-2蛋白表達上調(P<0.01)(Fig 6A，B)，Bax、active-caspase-3與Cytochrome C蛋白表達下調(P<0.01)(Fig 6A、C，Fig 6A，E，Fig 6A，F)，且Bcl-2 / Bax比率上升(P<0.01)(Fig 6A、D)；而ICI182,780+Aβ25-35組和ICI182,780+Aβ25-35+Que組與毒性損傷組相比線粒體凋亡關鍵蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。提示Que可通過激活經典雌激素受體，抑制線粒體凋亡途徑關鍵蛋白的表達。

Fig 4 Effect of Que and Aβ25-35 on protein levels of ERα and ERβ in PC12 n=3)A: Detection of protein levels of ERα and ERβ by Western blot; B: Quantification analysis of ERα level; C: Quantification analysis of ERβ level. *P<0.05 vs control; ##P<0.01 vs Aβ25-35

Fig 5 Effect of Que and Aβ25-35 on protein levels of Bcl-2, Bax, active-caspase 3 and cytochrome C in PC12 n=3)1： Control； 2：Aβ25-35； 3：17β-E2; 4: Gen; 5: Que/40 μmol·L-1; 6: Que/60 μmol·L-1; 7: Que/80 μmol·L-1. A: Detection of protein levels of Bcl-2, Bax, active-caspase 3 and Cytochrome C by Western blot; B: Quantification analysis of Bcl-2 level; C: Quantification analysis of Bax level; D: Quantification analysis of Bcl-2/Bax level; E: Quantification analysis of active-caspase- 3 level; F: Quantification analysis of cytochrome C level. *P<0.05，**P<0.01 vs control; #P<0.05，##P<0.01 vs Aβ25-35

Fig 6 Effect of Que and Aβ25-35 on protein levels of Bcl-2, Bax, active-caspase- 3 and cytochrome C in PC12 cells pretreated with ICI182,7801: Aβ25-35/20 μmol·L-1; 2: Que/60 μmol·L-1; 3: ICI/1 μmol·L-1. A: Detection of protein levels of Bcl-2, Bax, active-caspase- 3 and cytochrome C by Western blot; B: Quantification analysis of Bcl-2 level; C: Quantification analysis of Bax level; D: Quantification analysis of Bcl-2/Bax level; E: Quantification analysis of active-caspase- 3 level; F: Quantification analysis of cytochrome C level. *P<0.05，**P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs Aβ25-35;△△P<0.01 vs Aβ25-35+Que(60 μmol·L-1)

3 討論

大量研究表明，雌激素通過多種機制發揮神經保護作用，但由于雌激素的不良反應造成臨床應用存在爭議，研究探討雌激素神經保護作用的靶點，進一步認識神經系統疾病發生與發展機制，開發防治神經退行性疾病的雌激素受體調節劑，從而有可能為臨床上AD等神經系統疾病的防治提供新的策略和思路。越來越多的證據表明，AD患者腦內細胞淀粉樣蛋白沉積出現之前，線粒體功能障礙是認知老化和AD發病的早期事件，線粒體損傷又進一步誘導細胞凋亡和神經元丟失，加劇AD的進展。減輕線粒體功能障礙并提供神經保護作用的藥物有望用于AD治療。因此，改善線粒體損傷成為AD防治需要關注的問題。我們實驗研究揭示了Que可通過介導ERα作用于線粒體靶點起到神經保護作用，從分子角度為 Que 在治療AD和線粒體途徑凋亡相關的神經退行性疾病的潛在應用提供實驗依據。

由線粒體主導的細胞凋亡過程中關鍵環節為Cytochrome C的釋放，當細胞受到外界刺激產生凋亡信號，促進Bax過表達，并移位到線粒體膜上，打破線粒體膜電位的平衡，建立釋放因子通道，釋放Cytochrome C，與胞質中caspase-9前體結合形成凋亡體，增強caspase-3活性，促進細胞凋亡。而激活Bcl-2可以抑制各種刺激引起的caspase-3凋亡途徑和Cytochrome C的釋放，并且Bcl-2 / Bax表達比值與線粒體膜通透性成正相關。本實驗表明，Que能夠明顯促進Bcl-2蛋白表達，升高線粒體膜電位，下調Bax、active-caspase-3的表達，減少Cytochrome C的釋放，調控Aβ25-35造成的細胞凋亡。另外，實驗發現Que還可提高毒性損傷的細胞內線粒體琥珀酸脫氫酶(SDH)活力和線粒體Na+,K+-ATP酶活力，保證胞內能量代謝正常運行，維持線粒體環境穩態。

研究發現Bcl-2基因序列上含有雌激素反應位點，雌激素抑制細胞凋亡作用可能通過與ER結合直接促進Bcl-2的表達[10]。有證據已表明雌激素可通過介導ER調節線粒體功能障礙，以線粒體為靶向抑制H2O2誘導的神經元凋亡[11]。為探討Que保護PC12細胞免受Aβ25-35造成的線粒體損傷是否通過介導雌激素受體，采用Aβ25-35毒性損傷處理PC12，Western blot 檢測到毒性損傷組ERα表達與對照組相比明顯下調，Que、17β-E2、Gen和Aβ25-35分別共同孵育后，與Aβ25-35毒性損傷組相比ERα表達量明顯升高，ERβ 表達量組間無差異，表明Que可通過與17β-E2、Gen相似的保護作用機制，減少Aβ25-35毒性損傷造成的細胞凋亡；加入ICI182，780抑制劑進行干預后發現ICI182，780預孵育可減弱Que的抗凋亡作用，以及扭轉Que對線粒體功能的保護和線粒體凋亡相關蛋白表達的影響。