VU0360172激活mGluR5對新生大鼠生發基質出血的保護作用

王筱雅，馮占輝，熊 英，張 晴，楊 清，陳惠心，汪朝云，左 丁，葉 蘭

(1.貴州醫科大學 1.基礎醫學院藥理學教研室、2.附屬醫院神經內科、3.基礎醫學院機能學實驗室，貴州 貴陽 550025)

生發基質出血(germinal matrix hemorrhage，GMH)是發生于早產兒的一類嚴重腦出血疾病，其出血位置源自側腦室下方室管膜區域的生發基質層，這里是嬰幼兒重要的神經發生部位，其中富含脆弱的血管。因未成熟的大腦缺乏自我調節功能，故早產兒腦部血流產生波動便極易造成血管破裂，從而發生出血[1]。GMH在早產兒及低體重出生兒中的發病率和死亡率極高，并伴有腦癱、癲癇、發育遲緩等神經系統后遺癥[2]，嚴重危害早產兒的生命與健康。目前臨床上仍然缺乏有效的治療藥物，故探索新型治療靶點具有重要的醫學意義。

代謝型谷氨酸受體5(metabotropic glutamate receptor 5，mGluR5)是一種G蛋白偶聯受體(G protein coupled receptor，GPCR)，在神經元細胞膜上有表達，在神經網絡調節中起重要作用[3]，參與突觸可塑性和痛覺調節[4]。有研究發現，激動mGluR5在創傷性腦損傷[5]、蛛網膜下腔出血[6]、成人腦出血[7]、腦缺血[8]等神經系統疾病模型中發揮出較良好的療效，有抗神經元凋亡、增強神經發生、改善神經功能的作用，但在GMH模型中的作用尚未有研究報道。VU0360172是一種新型的mGluR5正向變構調節劑，具有特異性好、口服利用率高、可透過血腦屏障等特點[9]，有研究表明，用VU0360172激動mGluR5可有效改善癲癇[10]和蛛網膜下腔出血引起的神經功能損傷。本文探討了利用VU0360172激動mGluR5對生發基質出血產生的保護作用，并初步探究其產生保護作用的機制可能與抗神經元凋亡有關。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1動物 新生7日齡SD大鼠129只，♀♂各半，體質量(13～16) g，SPF級，購于貴州醫科大學實驗動物中心，生產許可證SCXK(遼)2020-0001。使用許可證SYXK(黔)2018-0001。

1.1.2主要材料與試劑 異氟烷：深圳瑞沃德生命科技有限公司；Ⅶ-S型膠原酶(批號：128M4107V)：美國Sigma公司；TESCA緩沖液(pH 7.4，批號：20191114)：索萊寶公司；VU0360172(批號：0586901-1)：Cayman公司；都氏試劑：上海羽朵生物科技有限公司；多聚甲醛固定液、SWE快速高分辨電泳緩沖液、轉膜緩沖液粉末、抗β-actin抗體(批號：Ls202319)：武漢賽維爾生物科技有限公司；預染蛋白質分子量標準(批號：00864849)：Thermo Fisher公司；氟化聚偏乙烯PVDF微孔轉移膜(批號：R0BB23468)：Millipore公司；高效封閉液：Genefist公司；抗mGluR5(批號：34r8599)、cleaved-caspase-3(批號：15z0096)、辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)抗體(批號：56j9958)、ECL發光液(批號：1824c03)：艾菲公司；抗Bcl-2抗體(批號：I07161556)：萬類公司。

1.1.3儀器 小動物麻醉機、腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；天平(METTLER TOLEDO公司)；電熱鼓風干燥箱(上海博迅實業)；酶標儀(BioTek公司)；高速冷凍離心機(Eppendorf公司)；正置光學顯微鏡(日本尼康)；電泳轉膜儀(北京六一儀器廠)；凝膠成像系統(Bio-Rad公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1造模 新生7日齡SD大鼠稱重編號，誘導麻醉后固定于腦立體定位儀上，切開頭皮暴露前囟，以前囟為原點，坐標1.6 mm(前)和1.5 mm(右)處鉆一1 mm小洞，用微量進樣針插入硬腦膜下2.7 mm(深)處，以1 μL·min-1速度注射膠原酶共0.3 U，留針5 min防止泄露。拔針后用骨蠟封住顱骨小洞，縫合頭皮。術后放置于37 ℃環境中恢復蘇醒，然后放回母鼠身邊。假手術組僅進行腦部進針，不注射膠原酶。

1.2.2實驗分組 實驗共分為5組：假手術組(Sham組)；模型組(GMH組)；VU0360172低、中、高劑量組(0.75 mg·kg-1、1.5 mg·kg-1、3.0 mg·kg-1)。每組21只大鼠。

1.2.3給藥 造模后3 h，VU0360172按低、中、高劑量給藥(i.p.)，假手術和模型組給予等容積的溶劑(0.02 DMSO+0.1吐溫80+0.2 PEG400+生理鹽水)。

1.2.4短期行為學測試 造模后24 h進行，每組6只大鼠，測試完成繼續進行后續實驗。

1.2.4.1 翻正反射 用手將乳鼠仰面固定于臺面上，松手后記錄其由仰臥姿勢完全翻正為四足站立所需的時間。

1.2.4.2 負趨地性 將乳鼠頭朝向下方，置于一呈45°傾斜角的粗糙斜面上，記錄乳鼠倒轉180°所需的時間。

1.2.4.3 神經功能缺陷評分 采用Longa評分[11]，評分標準：0分，正常行走；1分，左側前肢伸展不完全；2分，行走過程向對側轉圈；3分，行走過程中跌倒；4分，意識喪失，無自主行為。

1.2.5腦含水量測定 造模后24 h斷頭取腦，稱取腦組織濕重，100 ℃烘干24 h稱取干重。腦組織含水量/%=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%。每組6只。

1.2.6血紅蛋白測定 造模后24 h將乳鼠麻醉，PBS心臟灌流后斷頭取腦，稱取右側半球置于EP管中，加入2 mL PBS，冰上超聲1 min，4 ℃ 13 000 r·min-1離心20 min，取上清液20 μL，按1 ∶4比例加入都氏試劑，室溫下充分靜置15 min，酶標儀540 nm處比色。每組6只。

1.2.7HE染色 造模后24 h乳鼠麻醉，斷頭取腦，迅速放入多聚甲醛固定液進行固定，石蠟包埋切片，進行蘇木精-伊紅染色，顯微鏡鏡檢乳鼠腦組織病理學變化。每組3只。

1.2.8Western blot檢測 Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白的表達 造模后24 h心臟灌流取腦。180 mA轉膜，快速封閉液室溫封閉10 min，加入抗Bcl-2、cleaved-caspase-3抗體，4 ℃孵育過夜。每組6只。

2 結果

2.1 VU0360172對GMH乳鼠神經功能的影響與假手術組相比，模型組在翻正反射和負趨地性實驗中所消耗時間增長，神經行為學評分升高(P<0.01)。與模型組相比，VU0360172給藥高劑量組明顯縮短乳鼠神經行為學測試所需時間，神經功能缺陷評分降低，結果差異具有顯著性(P<0.05)(Fig 1)。

Fig 1 Effect of VU0360172 on neurobehavioral S: Sham; G: GMH; L: VU0360172 0.75 mg·kg-1; M: VU0360172 1.5 mg·kg-1; H: VU0360172 3.0 mg·kg-1. Respective time taking for body righting test and negative geotaxis test and neurological scores estimated 24 h after GMH. **P<0.01 vs Sham; #P<0.05， ##P<0.01 vs GMH.

2.2 VU0360172對GMH乳鼠腦含水量和腦血紅蛋白含量的影響與假手術組相比，模型組乳鼠腦含水量和腦血紅蛋白含量顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，VU0360172給藥高劑量組乳鼠腦含水量和血紅蛋白含量降低，結果差異具有顯著性(P<0.05)(Fig 2)。

Fig 2 Effect of VU0360172 ameliorating outcomes of GMH in n=6)S: Sham; G: GMH; L: VU0360172 0.75 mg·kg-1; M: VU0360172 1.5 mg·kg-1; H: VU0360172 3.0 mg·kg-1. A: Brain water content. B: Quantification of brain blood volume 24 h after GMH. **P<0.01 vs sham; #P<0.05，##P<0.01 vs GMH.

2.3 VU0360172對GMH乳鼠腦組織病理形態學的影響HE染色結果表明，與假手術組相比，模型組患側側腦室顯著增寬，基底節區結構破壞，基底節區和腦室下區(subventricular zone, SVZ)可見廣泛紅細胞和炎性細胞浸潤。VU0360172低劑量組與模型組比較無明顯差別。中劑量組側腦室中度擴大，基底節區結構輕度破壞，SVZ區炎性細胞浸潤明顯。高劑量組側腦室輕度擴大，基底節區有少量紅細胞浸潤，SVZ區可見紅細胞和炎性細胞浸潤，但面積較中劑量組明顯減少，病理損傷明顯改善(Fig 3)。

Fig 3 Histochemistry staining of rat brain (×200)S: Sham; G: GMH; L: VU0360172 0.75 mg·kg-1; M: VU0360172 1.5 mg·kg-1; H: VU0360172 3.0 mg·kg-1.

2.4 VU0360172對GMH乳鼠大腦凋亡相關蛋白水平的影響Western blot結果顯示，與假手術組相比，模型組腦中Bcl-2蛋白表達減少(P<0.05)，cleaved-caspase-3蛋白表達增加(P<0.01)。與模型組相比，VU0360172高劑量組明顯上調Bcl-2蛋白(P<0.05)，下調cleaved-caspase-3蛋白(P<0.01)(Fig 4)。

Fig 4 Effect of VU0360172 on apoptosis-related proteinS: Sham; G: GMH; L: VU0360172 0.75 mg·kg-1; M: VU0360172 1.5 mg·kg-1; H: VU0360172 3.0 mg·kg-1. A, B: Relative protein expression level of Bcl-2 and cleaved-caspase-3 24h after GMH. *P<0.05, **P<0.01 vs sham; #P<0.05， ##P<0.01 vs GMH.

3 討論

新生兒生發基質出血發生后，腦血管破裂出現大量血液，積血不僅會形成血塊阻塞腦脊液循環，加重腦積水[1]，血液成分的釋放還會引起神經元死亡[12]、小膠質細胞激活[13]、水通道蛋白表達改變[14]等病理反應，加劇腦損傷。

mGluR5是一種GPCR，在神經元細胞膜上表達，激動后具有抑制神經元凋亡，增強神經發生，調節小膠質細胞的功能，可產生抗炎、抗焦慮、抗精神病、抗癲癇的作用。有研究顯示，mGluR5激動劑CHPG可增強腦室下區域神經祖細胞的增殖，增強神經發生，對成人腦出血產生保護作用[7]。在腦缺血模型上，特異性激動mGluR5可通過PI3K-AKT通路產生保護作用[8]。故mGluR5是一個可通過不同途徑產生神經保護作用的受體。本研究結果發現，應用VU0360172后，可明顯改善GMH所致的乳鼠腦含水量和腦血紅蛋白含量的升高，并減少GMH造模后乳鼠神經行為學測試所消耗時間，降低神經功能缺陷評分。表明激活mGluR5后對GMH產生了治療效果。

Georgiadis等[15]的研究顯示，GMH的發病伴隨著細胞凋亡，故抑制細胞凋亡可能是藥物對GMH產生保護作用的一種途徑。Zhang等[6]也發現，在蛛網膜下腔出血模型中，激動mGluR5可以改善早期損傷，并有抑制神經元凋亡的作用。故本研究提出假設，在GMH模型中激動mGluR5是否會產生凋亡抑制的效應？凋亡是一種細胞程序性死亡，只有當細胞凋亡程序啟動時，半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)才會被激活，活化產生裂解的cleaved-caspase-3，裂解胞質和胞核底物，引起細胞凋亡，所以cleaved-caspase-3是細胞凋亡發生的重要指征和關鍵因子。而Bcl-2是重要的凋亡調控蛋白，Bcl-2的上調可抑制細胞凋亡。在本研究的WB結果中證實，GMH模型組的抗凋亡蛋白Bcl-2減少，裂解蛋白酶cleaved-caspase-3大量產生，說明細胞凋亡情況嚴重。給予VU0360172后，抗凋亡蛋白Bcl-2發生上調，而cleaved-caspase-3下調，細胞凋亡情況有所改善。綜上，激動mGluR5后對GMH乳鼠產生了治療效應，這種保護作用可能是通過抑制細胞凋亡所產生。

本研究主要聚焦于VU0360172激活mGluR5對GMH的保護作用，雖有其他研究也顯示mGluR5激動劑對蛛網膜下腔出血、創傷性腦損傷等中樞疾病有保護作用，但也有研究表明抑制mGluR5可治療帕金森[16]和阿爾茨海默癥[17]。同一受體對不同神經疾病的治療機制出現差異的原因，有可能是因為疾病本身的發病機制不同，急性創傷和慢性炎癥性疾病存在差異，且因受mGluR5影響的下游通路眾多，例如Akt-NF-κB通路[3]、PI3K-AKT通路等，受體可產生多種效應。本研究對mGluR5治療GMH的機制探討也僅是淺嘗輒止，對其抑制細胞凋亡的具體機制尚不清楚，將在后續實驗中對此進行更加深入的研究。