梓醇調控miR-143-3p干預Th17糖酵解和細胞分化的機制

申美玉，榮秋妮，狄昱希，田鋒祥，張明菲，王 祥，蔣寶平，周玲玲

(南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節滑膜炎癥為特征的慢性自身免疫性疾病，涉及心血管等多系統病變，其病理機制和生物標志物目前尚未完全闡明。CD4+輔助性T細胞(CD4+helper cells，Th)是適應性免疫細胞的主要群體之一，在不同的免疫環境下，na?ve CD4+T細胞能夠激活并分化成為不同的亞群(Th1/Th2/Th17/Tfh/Treg等)。有研究顯示[1]，Th17細胞的過度分化可促進RA的發展。因此，尋找造成RA中Th17細胞異常分化的關鍵因素對RA的防治至關重要。

免疫代謝研究表明，T細胞各亞群具有不同的代謝程序，其中Th17細胞特別依賴于糖酵解[2]。而RA疾病狀態下為保持持續的滑膜組織浸潤，其CD4+T細胞始終處于高合成代謝的細胞增殖狀態，主要表現為葡萄糖攝取異常增加、糖酵解增強、線粒體有氧氧化減弱，為Th17細胞分化提供了合適的條件[3]。因此，靶向CD4+T細胞中關鍵糖酵解酶葡萄糖轉運蛋白(Glut1)、己糖激酶(HK2)、丙酮酸激酶(PKM2)、乳酸脫氫酶(LDHA)等的表達可為臨床干預RA提供更多的治療方案。

MicroRNA(miRNA)是一種內源性的保守小分子，可以通過與靶分子mRNA的3′末端非翻譯區(3′UTR)結合而發揮轉錄后基因調節功能。多種miRNA被發現在RA CD4+T細胞中異常表達[4]，并且可以通過多種機制調節細胞的糖脂代謝[5]，這提示我們RA中miRNA表達異常可能通過調控糖酵解來介導Th17細胞的過度分化。最新研究顯示[6]，miR-143-3p可能是T細胞分化和功能的關鍵調節靶點，miR-143-3p過表達可通過靶向Glut1抑制葡萄糖攝取，促進記憶CD8+T細胞的分化并維持其抗腫瘤功能。同時，miR-143-3p可增加線粒體呼吸鏈復合物的表達水平，提示miR-143-3p的下調可能介導了細胞從線粒體有氧氧化向糖酵解的代謝轉換[7]。

生地具有清熱生津、涼血止血等功效，臨床可治療以“陰虛絡熱”為主要病機的RA，其主要活性成分梓醇(catalpol，CAT)可明顯改善Th17細胞異常分化，減少炎性因子分泌，緩解RA病情[8]，但其作用機制的研究還不完善。項目組前期研究已發現，CAT對miR-143-3p的表達具有調控作用，且能夠顯著影響CD4+T細胞中糖酵解產物水平。因此，本研究擬選取RA患者外周血CD4+T細胞，檢測miR-143-3p及相關糖酵解關鍵酶的異常表達情況，初步分析二者的相關性，并建立體外誘導Th17細胞分化模型，結合miR-143-3p慢病毒轉染，探討CAT調控miR-143-3p對Th17糖酵解和細胞分化的干預作用和作用機制，為RA等慢性復雜疾病的臨床用藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1RA病例 經南京中醫藥大學附屬醫院倫理委員會審核(2016NL-KS14)，依據美國風濕病學會(ACR)1987年發布的診斷標準，選擇10例RA活動期患者。所有RA患者未進行免疫治療。健康對照組另收集5例健康志愿者(HCs)。

1.1.2動物 10只6～8周齡的SPF級♂ C57/BL6小鼠，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物合格號SCXK(浙)2019-0001。動物在南京中醫藥大學實驗動物中心飼養，自由飲食、飲水，遵循自然晝夜節律，室溫為(23±2)℃，濕度為0.4～0.6。南京中醫藥大學動物倫理委員會審核、批準所有動物操作(202103A010)。

1.1.3藥物 梓醇，購自上海源葉生物科技有限公司(貨號：B21678，純度≥0.98)。

1.1.4主要試劑 人CD4+T細胞分選磁珠(貨號557767)，購自美國BD公司；小鼠na?ve CD4+T細胞分選試劑盒(貨號130-104-453)、MACS分選緩沖液(貨號130-091-221)、LS柱(130-042-401)，購自德國美天旎公司；Mouse anti-CD3e(貨號553057)、Mouse anti-CD28(貨號553294)，購自美國BD公司；Mouse IL-6(貨號CG39)、Mouse IL-23(貨號CI18)、Mouse TGF-β(貨號CA59)，購自上海近岸科技有限公司；RPMI1640培養基(貨號C11875500B)、TRIzol裂解液(貨號15596026)，購自美國賽默飛世爾科技公司；紅細胞裂解液(貨號R1010)，購自北京索萊寶科技有限公司；miR-143-3p mimics(貨號133F0E6)、miR-143-3p inhibitor(貨號1341413)、轉染陰性對照(貨號133F0EC)、Trans G病毒感染液(貨號133F027)，購自上海吉凱基因公司；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(貨號MR101-02)、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix(貨號MQ101-02)、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(貨號R222-01)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(貨號Q711-02)，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；流式破膜固定劑(貨號554722)、Mouse CD4-FITC抗體(貨號553057)、Mouse IL-17A-PE抗體(貨號561020)，購自美國BD公司；小鼠IL-17A高敏ELISA試劑盒(貨號EK217HS)，購自聯科生物技術有限公司；丙酮酸測定試劑盒(貨號A081)、乳酸測定試劑盒(貨號A019-2-1)，購自南京建成生物工程研究所。

1.1.5主要儀器 5920R臺式低溫離心機，購自德國Eppendorf公司；LV100N光學顯微鏡，購自日本NIKON公司；Micro 21R高速冷凍離心機、HFU 486超低溫冰箱，購自美國賽默飛世爾科技公司；KQ-500E型超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司；CO2培養箱，購自日本SANYO電氣有限公司；autoMACS Pro全自動磁珠分選儀，購自德國美天旎公司；M200Pro酶標儀，購自瑞士TECAN公司；7500型熒光定量PCR儀，購自美國ABI公司；Gallios分析型流式細胞儀，購自美國Beckman公司。

1.2 實驗方法

1.2.1RA患者臨床指標觀察及標本采集 根據RA診斷標準，對所有RA患者疾病活動評分(DAS28)進行評估；并于清晨空腹狀態下采集患者靜脈血5 mL，其中1 mL用于血沉(ESR)、類風濕因子(RF)和C反應蛋白(CRP)水平檢測，4 mL用于分離外周血CD4+T細胞。RA患者及健康志愿者的具體情況如Tab 1所示。

Tab 1 Characteristics of patients with RA and HCs

1.2.2人外周血CD4+T細胞分離 無菌收集HCs和RA患者外周抗凝血，采用Ficoll密度梯度離心法提取外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)；每107個細胞加入人CD4+T細胞分選磁珠50 μL，室溫避光孵育30 min，BD緩沖液補足液面至1 mL并立即置于BD Imagnet磁力架上，10 min后，吸棄上清，即獲得人CD4+T細胞，留作后續qPCR檢測。

1.2.3小鼠na?ve CD4+T細胞分離與體外Th17誘導分化 取C57BL/6小鼠脾臟制備單個核細胞懸液，照小鼠na?ve CD4+T細胞分選試劑盒說明依次加入MACS buffer(40 μL/ 107個細胞)、Biotin-Antibody Cocktail(10 μL/107個細胞)、Anti-Biotin磁珠(20 μL/107個細胞)、CD44磁珠(10 μL/107個細胞)，4 ℃避光孵育10 min。打開MACS全自動磁珠分選儀，設置陰性選擇程序，將上述含免疫磁珠的細胞懸液加到LS柱中，收集柱下流出的液體，重復3次后離心(1 000 r·min-1，5 min)，棄上清，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基重懸、計數，使得細胞濃度為(0.5-1)×109·L-1。

將小鼠na?ve CD4+T細胞分別以2×105細胞/每孔接種于24孔板，24孔板應提前包被濃度為2 mg·L-1的anti-CD3、anti-CD28，每孔中分別加入細胞因子IL-6、IL-23、TGF-β至終濃度為25、20、5 μg·L-1[9]，同時進行相應的細胞實驗給藥處理，于37 ℃、5% CO2環境下繼續培養72 h。

1.2.4細胞實驗分組及處理 將CD4+T細胞分為Control組、miR-143-3p下調組、miR-143-3p上調組，每培養孔分別加入預先配制的陰性對照、miR-143-3p inhibitor、miR-143-3p mimics慢病毒感染復合物各100 μL，以誘導miR-143-3p的高表達/低表達；將CD4+T細胞分為Control組以及不同濃度的給藥組：CAT(20、40、80 mg·L-1)，Control組給予相同體積1640培養基；將CD4+T細胞分為Control組、miR-143-3p下調組、miR-143-3p下調 + CAT處理組，于miR-143-3p inhibitor慢病毒感染復合物處理12 h后，miR-143-3p下調 + CAT處理組加入CAT至終濃度為40 mg·L-1，miR-143-3p下調組給予相同體積RPMI1640培養基。

1.2.5qPCR檢測miR-143-3p、Glut1、HK2、PKM2、LDHA、RORγt表達 使用TRIzol法提取細胞總RNA，將其反轉錄成cDNA，以此cDNA為模板擴增DNA，檢測miR-143-3p、Glut1、HK2、PKM2、LDHA、RORγt mRNA的相對表達量，以U6作為miR-143-3p內參，以GAPDH作為Glut1、HK2、PKM2、LDHA、RORγt內參，結果用2-ΔΔCt表示。引物根據Primer 5.0引物設計軟件設計，再由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列如Tab 2所示。

Tab 2 Primers used for quantitative real-time PCR

1.2.6比色法檢測細胞培養上清丙酮酸、乳酸含量 收集細胞上清液及人外周血血清樣本，根據說明書進行操作后混勻，在分光光度計505 nm處檢測OD值，計算丙酮酸含量；在分光光度計530 nm處檢測OD值，計算乳酸含量。

1.2.7ELISA法檢測細胞培養上清IL-17A水平 收集細胞培養上清，嚴格按照小鼠IL-17A高敏ELISA試劑盒說明書操作，并分別于450和570 nm處檢測OD值，計算出對應的IL-17A濃度。

1.2.8流式細胞術檢測Th17細胞分化比例 收集體外誘導的Th17并用PBS洗滌1次，加入1 μLCD4-FITC流式抗體室溫避光孵育30 min，PBS清洗，加入1 mL破膜劑室溫避光孵育20 min，1 mL破膜洗液清洗，加入2 μL IL-17A-PE流式抗體室溫避光孵育40 min，破膜洗液清洗，加入500 μL PBS重懸細胞，置于流式細胞儀上檢測Th17分化比例。采用Flow Jo V10軟件分析并處理流式數據。

2 結果

2.1 RA患者miR-143-3p表達與糖酵解及Th17細胞分化的關聯性如Fig 1所示，與HC組比較，RA患者外周血CD4+T細胞中miR-143-3p表達明顯下降(P<0.05)，Th17特異性轉錄因子RORγt mRNA表達明顯升高(P<0.05)，Pearson′s分析結果表明，miR-143-3p表達與RORγt mRNA水平(P<0.05)、疾病嚴重度DAS28(P<0.01)具有相關性且均呈負相關；如Fig 2所示，與HC組比較，RA患者外周血CD4+T細胞中糖酵解關鍵酶Glut1、HK2、PKM2、LDHA mRNA表達均顯著升高(P<0.05)；Pearson′s分析結果得出，miR-143-3p表達與Glut1、HK2、LDHA mRNA表達水平具有相關性且均呈負相關(P<0.05)。

Fig 1 Correlation analysis of miR-143-3p and RORγt, DAS28 from RA patients HC: n=5; RA: n=10)(A-B) The relative expression of miR-143-3p and RORγt mRNA in peripheral blood CD4+T cells of RA patients and HCs was detected by RT-qPCR. *P<0.05 vs HC group by student′s t-test. (C) The correlation between miR-143-3p expression and DAS28 and RORγt mRNA expression. The Pearson correlation coefficient was determined.

Fig 2 Correlation analysis of Glut1, HK2, PKM2, LDHA mRNA relative expression and miR-143-3p from RA patients HC: n=5; RA: n=10)(A-D) The mRNA relative expression of Glut1, HK2, PKM2 and LDHA in peripheral blood CD4+T cells of RA patients and HCs was detected by RT-qPCR. *P<0.05 vs HC group by student’s t-test. (E-H) The correlation between miR-143-3p expression and Glut1, HK2, PKM2, LDHA mRNA expression. The Pearson correlation coefficient was determined.

2.2 MiR-143-3p異常表達對Th17分化及細胞糖酵解的影響如Fig 3所示，Th17細胞轉染miR-143-3p inhibitor后，miR-143-3p表達較Control組明顯降低(P<0.05)，轉染miR-143-3p mimics后，miR-143-3p表達較Control組明顯升高(P<0.01)，表明轉染成功；如Fig 4所示，轉染miR-143-3p inhibitor后，RORγt mRNA水平及上清IL-17A水平較Control組明顯升高(P<0.05)，轉染miR-143-3p mimics后，RORγt mRNA水平及上清IL-17A水平較Control組明顯降低(P<0.05)，提示miR-143-3p能夠負調控Th17細胞分化及分泌活性；同時，如Fig 5所示，Th17細胞轉染miR-143-3p inhibitor后，Glut1、HK2、LDHA mRNA水平較Control組明顯升高(P<0.01)，其細胞培養上清中丙酮酸水平也明顯升高(P<0.05)；而在轉染miR-143-3p mimics后，HK2、LDHA mRNA水平較Control組明顯下降(P<0.01)，其細胞培養上清中乳酸水平也明顯下降(P<0.05)，提示miR-143-3p能夠負調控Th17的細胞糖酵解。

Fig 3 The mRNA relative expression of miR-143-3p in miR-143-3p mimics/inhibitor-transfected Th17 cells n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs control group.

Fig 4 The mRNA relative expression of RORγt and level of IL-17A in miR-143-3p mimics/inhibitor-transfected Th17 cells n=3)CD4+T cells were transfected with miR-143-3p mimics or inhibitor for 12 h, then cultured with the condition of Th17-polarization for 72 h. (A) The mRNA relative expression of RORγt in CD4+T cells was detected by RT-qPCR. (B) The IL-17A levels in cell supernatant was determined by ELISA. *P<0.05，**P<0.01 vs control group by one-way ANOVA with Dunnett′s post-hoc test.

Fig 5 The mRNA relative expression of Glut1, HK2, LDHA and levels of pyruvate, lactate in miR-143-3p mimics/inhibitor-transfected Th17 cells n=3)CD4+T cells were transfected with miR-143-3p mimics or inhibitor for 12 h, then cultured with the condition of Th17-polarization for 72 h. (A) The mRNA relative expression of Glut1, HK2 and LDHA in CD4+T cells was detected by RT-qPCR. (B-C) The pyruvate and lactate levels in cell supernatant. *P<0.05，**P<0.01 vs control group by one-way ANOVA with Dunnett′s post-hoc test.

2.3 CAT對miR-143-3p表達和Th17細胞分化的影響如Fig 6所示，與Control組比較，CAT處理后Th17細胞分化比例、IL-17A分泌水平、RORγt mRNA表達水平均呈劑量依賴性下降(P<0.01)，提示CAT可明顯抑制Th17細胞分化和分泌活性；而與Control組相比，CAT處理后miR-143-3p表達水平呈劑量依賴性上升(P<0.01)，提示CAT可促進Th17細胞中miR-143-3p表達，見Fig 7。

Fig 6 Frequency of Th17 cells and level of IL-17A and RORγt mRNA relative expression after CAT treatment n=3)CD4+T cells (with the condition of Th17-polarization) were treated with CAT (20, 40, 80 mg·L-1) for 72h. (A-B) Representative dot plots and the percentage of Th17 (CD4+IL-17A+) cells was determined by flow cytometry. (C) The mRNA relative expression of RORγt in CD4+T cells was detected by RT-qPCR. (D) The IL-17A levels in cell supernatant was determined by ELISA. *P<0.05，**P<0.01 vs control group by one-way ANOVA with Dunnett's post-hoc test.

Fig 7 The mRNA relative expression of miR-143-3p after CAT treatment n=3)**P<0.01 vs control group.

2.4 CAT對Th17細胞糖酵解的影響如Fig 8所示，與Control組比較，CAT處理后糖酵解關鍵酶HK2、LDHA mRNA表達水平呈劑量依賴性降低(P<0.01)，糖酵解代謝產物丙酮酸、乳酸也同樣隨劑量依賴性下降(P<0.05)，提示CAT可顯著抑制Th17的細胞糖酵解。

Fig 8 The mRNA relative expression of Glut1, HK2, LDHA and levels of pyruvate, lactate after CAT treatment n=3)CD4+T cells (with the condition of Th17-polarization) were treated with CAT (20, 40, 80 mg·L-1) for 72h. (A) The mRNA relative expression of Glut1, HK2 and LDHA in CD4+T cells was detected by RT-qPCR. (B-C) The pyruvate and lactate levels in cell supernatant. *P<0.05，**P<0.01 vs control group by one-way ANOVA with Dunnett′s post-hoc test.

2.5 CAT對miR-143-3p低表達狀態下Th17細胞分化的干預作用如Fig 9所示，與Control組比較，miR-143-3p inhibitor組miR-143-3p表達明顯降低(P<0.05)，提示轉染成功，而miR-143-3p inhibitor結合CAT給藥組較miR-143-3p inhibitor組miR-143-3p表達明顯升高(P<0.01)，提示CAT可恢復Th17細胞中miR-143-3p的被抑制狀態；同時，與miR-143-3p inhibitor組比較，miR-143-3p inhibitor結合CAT給藥組Th17細胞分化比例、IL-17A分泌水平、RORγt mRNA水平均明顯降低(P<0.01)，并恢復至與Control組同等的水平(Fig 10)，提示CAT可明顯抑制miR-143-3p低表達狀態下Th17細胞的異常分化。

Fig 9 The mRNA relative expression of miR-143-3p in miR-143-3p low expression-Th17 cells after CAT treatment n=3)*P<0.05 vs control group; ##P<0. 01 vs miR-143-3p inhibitor group.

Fig 10 Frequency of Th17 cells and level of IL-17A and RORγt mRNA relative expression in miR-143-3p low expression-Th17 cells after CAT treatment n=3)CD4+T cells were transfected with miR-143-3p inhibitor for 12 h, then treated with CAT (40 mg·L-1) under the condition of Th17-polarization for 72 h. (A-B) Representative dot plots and the percentage of Th17 (CD4+IL-17A+) cells was determined by flow cytometry. (C) The mRNA relative expression of RORγt in CD4+T cells was detected by RT-qPCR. (D) The IL-17A levels in cell supernatant was determined by ELISA. **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs miR-143-3p inhibitor group by one-way ANOVA with Dunnett′s post-hoc test.

2.6 CAT對miR-143-3p低表達狀態下Th17細胞糖酵解的干預作用進一步驗證CAT調控miR-143-3p對Th17分化的干預作用是否與細胞糖酵解有關。如Fig 11所示，與miR-143-3p inhibitor組比較，miR-143-3p inhibitor結合CAT給藥組HK2、LDHA mRNA表達水平(P<0.01)，代謝產物丙酮酸、乳酸水平均明顯降低(P<0.05)，其抑制程度與control組類似，提示CAT可恢復miR-143-3p低表達狀態下Th17細胞的糖酵解異常上調。

Fig 11 The mRNA relative expression of HK2, LDHA and levels of pyruvate, lactate in miR-143-3p low expression-Th17 cells after CAT treatment n=3)CD4+T cells were transfected with miR-143-3p inhibitor for 12 h, then treated with CAT (40 mg·L-1) under the condition of Th17-polarization for 72h. (A-B) The mRNA relative expression of HK2 and LDHA in CD4+T cells was detected by RT-qPCR. (C-D) The pyruvate and lactate levels in cell supernatant. **P<0.01 vs control group; ##P<0. 01 vs miR-143-3p inhibitor group by one-way ANOVA with Dunnett′s post-hoc test.

3 討論

Th17細胞作為CD4+T細胞中特異性分泌IL-17的細胞亞群，不僅可以清除細胞外細菌及霉菌，也可介導機體炎癥反應、自身免疫及移植排斥反應。RA是目前常見的自身免疫性疾病，大量研究表明Th17細胞的異常分化可影響RA的疾病進程，因此，調控Th17細胞的過度分化是RA免疫治療的研究熱點。前期項目組研究已發現，CAT可明顯下調膠原誘導關節炎(CIA)小鼠中Th17細胞的分化及分泌活性，有效緩解小鼠關節炎癥的進展[10]。本研究結果同樣顯示，生地中主要活性成分CAT可在體外顯著抑制Th17細胞分化比例，下調Th17細胞特

征性轉錄因子RORγt mRNA水平，減少Th17細胞特征性細胞因子IL-17A分泌，進一步證明CAT可顯著抑制Th17細胞的分化和功能。但CAT調控Th17細胞分化的作用機制目前尚不明確。

miRNA是一種保守的內源性非編碼RNA，其調控作用幾乎涉及包括細胞增殖分化、細胞間信號通路傳導、自噬、凋亡在內的所有生物學過程，是CD4+T細胞分化與效應功能發揮的重要調節劑[11]。項目組前期針對RA患者、CIA小鼠外周血miRNAs表達進行檢測，共篩選出包括miR-143-3p在內的6種miRNAs存在表達失調[12]，其中miR-143-3p作為一種典型的多功能microRNA，已被證實在多種自身免疫性疾病及炎癥模型(RA、慢性結腸炎、膠原誘導小鼠關節炎模型等)中表達出現異常下調[13-15]。同時，多項研究顯示，miR-143-3p可抑制Th17細胞分化所需的IL-6、IL-23分泌[16]。結合項目組前期發現CAT可顯著促進CD4+T細胞中miR-143-3p表達，本實驗進一步嘗試研究CAT通過miR-143-3p調控Th17細胞分化的作用機制。

本研究結果提示，與健康對照組比較，RA患者CD4+T細胞中miR-143-3p表達明顯下降，Th17特異性轉錄因子RORγt mRNA表達明顯升高，且miR-143-3p表達與RORγt水平、疾病嚴重度DAS28均呈負相關，提示RA患者CD4+T細胞中存在miR-143-3p的表達異常，這可能是RA中Th17異常分化、疾病持續發展的關鍵因素之一；進一步建立體外誘導Th17細胞分化模型，并結合慢病毒轉染誘導miR-143-3p的高表達/低表達，發現過表達miR-143-3p后，RORγt mRNA水平及IL-17A分泌水平均顯著降低，反之則顯著升高，表明miR-143-3p可負調控Th17細胞分化及分泌活性，可成為Th17介導的RA疾病治療的有效靶點。因此，本實驗繼續在miR-143-3p低表達細胞模型的基礎上，結合CAT給藥，以進一步觀察CAT對miR-143-3p抑制狀態下Th17細胞分化的調控作用。實驗結果顯示，與miR-143-3p inhibitor組比較，miR-143-3p inhibitor結合CAT給藥組miR-143-3p的表達明顯上調，表明CAT可明顯逆轉Th17細胞分化過程中miR-143-3p的異常下調。同時，與miR-143-3p inhibitor組比較，miR-143-3p inhibitor結合CAT給藥組Th17細胞分化比例、IL-17A分泌水平、RORγt表達水平均明顯降低，表明CAT通過誘導miR-143-3p表達來抑制CD4+T細胞向Th17細胞亞群分化。然而，miR-143-3p潛在的調節范圍仍不確定，一種miRNA往往可以與多種基因相互作用，一種基因也往往含有多個miRNA識別位點。因此，接下來本實驗重點關注miR-143-3p是通過何種途徑調控Th17細胞的分化和功能。

多項研究表明，RA疾病進展與病灶處CD4+T細胞的代謝變化特點密切相關，由于RA關節滑膜腔是一個相對缺氧的局部微環境，導致了CD4+T細胞從氧化磷酸化向糖酵解的代謝轉換，而糖酵解的異常上調則可誘導CD4+T細胞向致炎性的Th17細胞亞群的持續分化，加重滑膜炎癥[17]。miRNAs可通過復雜的機制調控細胞代謝過程，包括直接靶向代謝過程的關鍵分子(轉運體或酶/激酶)和調節多種信號通路[5]。而miR-143-3p作為調控抑癌基因的非編碼小RNA，已被發現能夠直接靶向HK2的轉錄表達，抑制腫瘤細胞糖酵解，減緩其增殖能力[18]。結合CAT對糖脂代謝的調控作用，推測CAT調控miR-143-3p對Th17細胞分化的干預作用是否與糖酵解有關。

本研究結果提示，RA患者外周血CD4+T細胞中糖酵解關鍵酶Glut1、HK2、LDHA mRNA表達顯著上調，且與miR-143-3p呈負相關，提示RA患者CD4+T細胞中的糖酵解失調可能與miR-143-3p有關；慢病毒轉染誘導Th17細胞體外分化過程中miR-143-3p的高表達/低表達，發現抑制miR-143-3p后，Glut1、HK2、LDHA mRNA水平及丙酮酸、乳酸分泌較Control組顯著升高，反之則明顯降低，表明miR-143-3p可以負調控Th17細胞糖酵解。結合該調控機制的研究結果，研究進一步觀察了CAT對Th17細胞體外分化過程中糖酵解的影響，結果顯示，CAT處理后Th17細胞中糖酵解酶HK2、LDHA的mRNA水平以及代謝產物丙酮酸、乳酸的分泌水平均呈劑量依賴性下降，表明CAT可顯著下調Th17分化過程中的細胞糖酵解。結合慢病毒轉染誘導miR-143-3p的低表達，發現與miR-143-3p inhibitor組比較，miR-143-3p inhibitor結合CAT給藥組HK2、LDHA mRNA水平，丙酮酸、乳酸分泌水平均明顯降低，表明CAT可恢復miR-143-3p低表達狀態下的糖酵解異常上調和Th17細胞異常分化。

綜上所述，本研究證實miR-143-3p可負調控Th17細胞分化及分泌活性，可成為Th17介導的RA疾病治療的有效靶點，且miR-143-3p對Th17細胞的調控作用可能與其糖酵解有關。CAT可上調miR-143-3p，同時抑制Th17細胞的異常分化和糖酵解異常上調，表明CAT可通過調控miR-143-3p，抑制細胞糖酵解并干預Th17的異常分化，這可能是生地調節機體免疫平衡，發揮抗炎作用的重要機制之一，這為生地在RA等自身免疫病中的合理應用提供了實驗基礎。