基于網絡藥理學和斑馬魚模型的杜仲抗帕金森病作用

張鵬宇，靳 夢，商學良，張姍姍，李麗娜

(1.華北理工大學心理與精神衛生學院，河北 唐山 063200；2.齊魯工業大學(山東省科學院)生物研究所， 山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室，山東 濟南 250103)

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)，是世界第二大神經退行性疾病，其患病率隨著患者年齡的增加而上升。主要表現出行動遲緩、靜止性震顫、肌肉僵直等癥狀。.造成PD的主要原因為腦內多巴胺神經元的減少，進而對紋狀體分泌多巴胺(dopamine，DA)產生影響[1]。DA主要通過多巴胺受體(dopamine receptor，DR)發揮正常功能。DR包括激活性受體D1類(DRD1和DRD5)和抑制性受體D2類(DRD2、DRD3和DRD4)[2]。其中，DRD1、DRD2和DRD3常見于黑質-紋狀體和中腦-邊緣系統，并且在腦內有豐富的表達量，主要參與行為和情緒的調控[3]；DRD4主要分布于海馬區，對神經傳遞起到調節作用[4]；DRD5是信息傳遞和神經沖動傳遞的重要功能性受體[5]。

臨床大多采用化學制劑治療PD，雖然PD癥狀在一定程度上有所緩解，但長期服用會出現一系列不良反應，藥效也會逐漸減退。此外，這些藥物無法修復多巴胺神經元的損傷，也不能緩解多巴胺神經元的退化。在現代醫學中，PD的發病機制尚不明確，大多認為與多巴胺神經元有關。杜仲是中國特有的木本植物，廣泛生長于中國中南部。早在2000多年前，杜仲已有入藥記載，并且杜仲在保護神經元方面具有較好的效果。因此，研究杜仲可能具有抗PD活性。

網絡藥理學以中醫理念為基本研究方法，是闡明活性成分和中藥潛在機制的可行策略。斑馬魚模型是一種新型生物模型，因其體積小，繁殖快且產量大，身體透明易于觀察等特點已廣泛應用于活性評價中。此外，斑馬魚神經系統結構和發育過程與人類高度相似，實驗中常用來模擬人類相關疾病研究。本研究根據網絡藥理學結果，對杜仲抗PD可能存在的活性成分、作用靶點和通路進行預測，然后利用斑馬魚PD模型進行檢驗，明確杜仲抗PD的相關作用機制。

1 材料

1.1 藥物提取將干燥的杜仲進行磨粉處理，將粉末和純凈水按照1 ∶10的比例進行回流提取，回流2次，每次2 h，回流結束后將得到的混合液進行離心，取上清液進行抽濾，將抽濾后得到的液體進行旋蒸，待旋蒸瓶內的水分全部旋出，將其放入抽真空箱24 h，最終得到較為純凈的杜仲干燥粉末。以上藥物提取在山東省科學院藥物化學實驗室完成并檢測。

1.2 儀器北京愛生公司斑馬魚養殖系統，Viewpoint公司Zebrabox斑馬魚行為分析儀；羅氏有限公司實時熒光定量PCR儀器、蔡司光學有限公司熒光顯微鏡、伯樂生命醫學產品有限公司C1000 Touch梯度PCR儀、基因有限公司超微量分光光度計。

1.3 動物野生型斑馬魚AB和轉基因斑馬魚Vmat:GFP由山東省科學院生物研究所提供，在恒溫28 ℃的斑馬魚養殖系統中進行飼養，遵循照明黑暗14 h：10 h的生物節律，定點投食。

2 方法

2.1 杜仲活性成分篩選在藥理學數據庫與分析平臺TCMSP(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)，以“杜仲”為關鍵詞對其化學成分進行檢索。然后根據口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，藥物相似性(drug likeness，DL)≥0.18篩選有效活性成分。

2.2 杜仲活性成分潛在靶點收集在TCMSP中收集杜仲活性成分的相應靶點信息，然后通過Uniprot數據庫進行分析轉化，獲取與活性成分作用的相關靶點(人源)。

2.3 PD疾病相關靶點的篩選與收集以“Parkinson′s disease”為關鍵詞，在DISGENET數據庫(http:/ /www.disgenet.org/)中進行檢索，收集PD相關疾病靶點，篩選條件為：得分(score值)>0.1。

2.4 杜仲活性成分-潛在靶點-PD疾病靶點網絡構建根據TCMSP數據庫篩選出與杜仲活性成分相關的潛在靶點，利用cytoscape 3.7.2軟件繪制出杜仲活性成分-潛在靶點網絡圖，再將其結果與PD疾病靶點進行比對，生成杜仲活性成分-PD疾病網絡圖，并利用FUNRICHNEW.exe繪制杜仲和PD共有靶點的韋恩圖。

2.5 蛋白質相互作用網絡構建(protein-protein interaction，PPI)在STRING 數據庫(http:/ /string-db.org /cgi /input．Pl)輸入杜仲和PD共有的交集靶點蛋白名稱，獲取交集靶點蛋白信息，收集數據導入Cytoscape 3.7.2軟件，根據Drgee值拓撲分析構建出PPI網絡圖。

2.6 杜仲對治療PD靶點蛋白的GO功能富集分析和 KEGG通路富分析為了表明杜仲的藥物靶蛋白在基因功能中的作用，利用Metascape數據庫(https://metascape.org/gp/index.html)對PPI網絡中篩選出的核心靶點進行GO功能富集分析。之后使用Metascape對KEGG通路富集分析進行篩選，探討其緩解PD的作用通路并進一步對富集信號通路進行分析，獲得各通路相關網絡圖。

2.7 動物實驗方法

2.7.1實驗分組及處理 上午10時將1 dpf(day post fertilization，dpf)的胚胎進行脫膜處理，脫膜后的斑馬魚用養魚水反復沖洗2-3次，洗掉多余的脫膜劑。放入孵育箱2-3 h，使其適應溫度。本實驗分為以下3組:空白對照組、50 μmol·L-11-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶 (1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-terahydropyridine，MPTP)處理組、50 μmol·L-1MPTP與25 mg·L-1的杜仲共處理組。每日按時換藥，換完藥后放入培養箱進行培養。

2.7.2行為學監測 在6 dpf時，用48孔板進行斑馬魚行為學實驗，每孔1條，放入Zebrabox斑馬魚行為分析儀中，先使其適應環境10 min。之后開始檢測，檢測時間為20 min。運用Zeblab軟件進行數據處理，計算每條魚游動總距離和平均速度。

2.7.3斑馬魚腦內多巴胺神經元檢測 本實驗從1 dpf時給藥，連續給藥3 d，在3 dpf時用蔡司顯微鏡觀察轉基因斑馬魚Vmat：GFP多巴胺神經元的發育情況。

2.7.4熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 在6 dpf時，每組選取30條斑馬魚幼魚進行qRT-PCR檢測，將斑馬魚按組別放入EP管中，用清水沖洗2-3次，洗去多余的藥物殘留，最后將EP管中的水全部吸出，加入裂解液，在破碎機中研磨，使其完全裂解，然后將研磨后的裂解物放入離心機中離心，取上清液。RNA提取后，利用超微量分光光度計檢測所有組RNA的濃度，之后對RNA進行反轉，將反轉得到的cDNA進行稀釋，然后加入相應的引物用實時熒光定量PCR儀對各個基因進行擴增。擴增結束后，計算各組基因的相對表達量。

3 結果

3.1 杜仲抗PD有效成分及與PD靶點應用TCMSP數據分析平臺對杜仲活性成分進行收集，以類藥性五原則、OB≥30%、DL≥0.18為篩選條件。篩選結果去除重復項后，共得到26個杜仲有效活性成分(Tab 1)，包括β-谷甾醇(beta-sitosterol)、槲皮素(quercetin)和β-胡蘿卜素(beta-carotene)等。通過DISGENET數據庫檢索“Parkinson′s disease”，共挖掘到359個PD靶點。最終得到杜仲抗PD的潛在作用靶點共33個(Fig 1)，包括DRD1、DRD2、DRD3等。

Fig 1 Venn diagram of Eucommia ulmoides anti-PD targetVenn diagram of anti-PD targets of Eucommia ulmoides; Blue:The number of active components of Eucommia ulmoides was 199; Yellow:The number of PD targets was 359; Green:The number of intersection targetswas 33.

Tab 1 Information of active components of Eucommia ulmoides

3.2 杜仲抗PD作用靶點PPI網絡通過STRING數據庫對篩選出的杜仲抗PD的33個潛在作用靶點進行分析，獲取靶點相互作用信息(Fig 2)，得到33個節點和189條邊，提示杜仲抗PD的多靶點、多通路的作用特點。

Fig 2 PPI network of anti-PD targets of Eucommia ulmoides

3.3 GO功能富集分析對杜仲抗PD潛在靶點進行GO功能富集分析，共富集到41條結果，生物過程方面包括調節神經遞質(regulation of neurotransmitter levels)，分子功能方面涉及多巴胺神經受體活性(dopamine neurotransmitter receptor activity)(Tab 2)，提示多巴胺能神經系統的調節可能參與杜仲抗PD功能。

Tab 2 GO functional enrichment analysis results(top 20)

3.4 KEGG通路富集分析結果共富集得到10條通路與杜仲改善PD相關，包括癌癥的途徑(Pathways in cancer)、流體剪切應力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、鉑耐藥(platinum drug resistance)、小細胞肺癌(small cell lung cancer)、多巴胺能突觸(dopaminergic synapse)等(Tab 3和Fig 3)。值得注意的是，多巴胺能突觸相關信號通路與PD密切相關。

Tab 3 Results of KEGG pathway enrichment analysis

Fig 3 Bar chart of KEGG pathway enrichment analysis

3.5 杜仲改善斑馬魚PD樣癥狀——行為學驗證斑馬魚PD模型行為會表現出與PD患者類似的運動遲緩等現象，為了驗證杜仲的抗PD活性，本研究利用行為學進行驗證，結果如Fig 4。Fig 4A表示不同實驗組(n=10)斑馬魚游動的總距離，與空白對照組相比，造模組斑馬魚的游動距離明顯減少，游動速度也明顯降低(Fig 5B)；與造模組相比，杜仲處理組的游動總距離明顯增加(Fig 4A，杜仲處理組所示)，游動速度明顯變快(Fig 4B，杜仲處理組所示)，差異具有統計學意義。研究結果顯示，杜仲可以改善由MPTP造成的斑馬魚PD樣行為。

Fig 4 Eucommia ulmoides improved PD-like behavior of zebrafishA:The total swimming distance of zebrafish. B:The average speed of a zebrafish in the dark. The total distance of each zebrafish was analyzed by Zeblab software (**P<0.01 vs blank control group; #P<0.05,##P<0.01 vs Eucommia ulmoides treatment group).

Fig 5 Statistics of length of dopamine neurons in each group of zebrafishA:The picture shows the length of dopaminergic neurons in the head of each group of zebrafish given 3 dpf. The scale:100 μm. B:**P<0.01 vs blank control group;#P<0.05 vs model group.

3.6 杜仲改善斑馬魚PD樣癥狀——多巴胺神經元驗證多巴胺神經元損傷是PD特征之一，本研究通過觀察斑馬魚腦內多巴胺神經元損傷情況來驗證杜仲抗PD的活性(Fig 5)(n=8)。與空白對照組相比，造模組斑馬魚腦內多巴胺神經元長度明顯減少；與造模組相比，杜仲處理組斑馬魚腦內的多巴胺神經元長度有所恢復。該實驗表明，杜仲可以緩解斑馬魚腦內多巴胺神經元的損傷。本研究以行為和多巴胺神經元兩個指標對杜仲緩解PD樣癥狀進行驗證，結果提示杜仲具有抗PD活性。

3.7 杜仲改善斑馬魚PD樣癥狀——DA相關基因驗證為進一步驗證和挖掘杜仲抗PD活性的作用機制，本研究利用qRT-PCR對不同實驗組的PD相關基因drd1、drd2和drd3進行檢測(Fig 6)。與空白對照組相比，造模組中的drd1、drd2和drd3的表達明顯下調，具有統計學意義；與造模組相比，杜仲處理組中drd1和drd2的表達明顯增加，drd3雖不具有統計學意義，但也出現了上調的趨勢。研究結果表明，杜仲可以對DA相關基因的異常表達進行調控。

Fig 6 Expression of dopamine-related genes in PDA:gene drd1, B:gene drd2, C:gene drd3. *P<0.05, **P<0.01 vs blank control group; ##P<0.01 vs model group

4 討論

通過網絡藥理學方法，本研究篩選得到了26個杜仲有效成分，構建杜仲活性成分-潛在靶點網絡，并從中預測β-谷甾醇、槲皮素和β-胡蘿卜素為杜仲抗PD的重要有效成分。以往研究表明[6]，β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化和神經保護功效。槲皮素可以通過降低神經元活性氧水平，增加谷胱甘肽的表達發揮抗氧化功能，從而起到保護神經的作用[7]。研究發現[8]，PD患者血清中α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素水平均明顯降低，且與病情嚴重程度相關，推測PD的發生與血清中類胡蘿卜素的水平有關。因此上述成分可能作為杜仲改善PD的有效藥物成分。

本課題組前期研究發現[9-10]，斑馬魚PD模型在運動能力方面出現運動遲緩、游動總距離降低、游動速度變慢等現象。杜仲葉顯著降低了斑馬魚PD模型腦中多巴胺能神經元和神經血管的丟失，改善了運動障礙，減少了腦部細胞凋亡數量。機制研究發現杜仲葉可以激活自噬，促進α-syn降解，從而減輕斑馬魚PD樣癥狀。有研究發現[11]，MPTP誘導的小鼠PD模型與健康組小鼠相比，自主運動能力、協調性和耐受力都有所下降。崔爽等[12]研究發現，在6-羥基多巴胺誘導的大鼠PD模型中，杜仲可以減輕氧化應激反應，使多巴胺能神經元細胞減少。本研究結果顯示，造模組多巴胺神經元長度比對照組明顯減少，運動距離和運動速度明顯降低，造模成功，杜仲處理組與造模組相比多巴胺神經元長度顯著增長，游動總距離明顯增加，游動速度明顯變快。研究結果表明，杜仲可以緩解多巴胺神經元損傷，改善斑馬魚PD樣行為。斑馬魚多巴胺神經元分布在中腦中縫核、室旁器官神經叢、前直腸神經叢、下丘腦中間神經叢等[13]，本研究以中縫核區多巴胺神經元的長度作為評價指標，對該多巴胺神經元區域長度進行了統計分析，但未開展神經元數量、突觸密度、樹突和軸突等指標的檢測，今后我們將進一步完善這方面的不足。

PPI結果提示，杜仲抗PD作用是通過多靶點、多通路實現的，且各靶點之間存在密切的聯系。例如，腫瘤壞死因子(TNF)和白細胞介素-1(IL-1B)之間存在相互作用。有研究顯示[14]，炎性因子IL-1B可以刺激TNF產生，使炎性反應加重。此外TNF-α還可誘導IL-1、IL-6等炎性因子激活。B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)和半胱氨酸蛋白酶(CASPASE-3)之間具有相互作用關系[15]，Bax/Bcl-2的表達比率決定著細胞凋亡的進程，其比值增加會將細胞凋亡的關鍵因子caspase-3激活。另有研究顯示[16]，蛋白激酶B(AKT)和糖原合成酶-3(GSK-3β)之間相互作用，AKT的激活可以促進GSK-3β的表達。

杜仲抗PD的GO富集分析結果顯示，杜仲具有調節神經遞質水平、多巴胺神經遞質受體活性等作用。KEGG通路富集分析結果發現，杜仲抗PD與多巴胺能突觸這一通路有關。通過上述結果推測，多巴胺能神經系統與杜仲改善PD癥狀緊密相關。PPI顯示，各靶點之間存在著緊密相關的聯系，其中，DRD1、DRD2和DRD3是與多巴胺能神經系統密切相關的調節因子。DR主要與DA結合，激活DR能夠調節軸突結構，保持大腦正常功能。DR廣泛分布于中樞神經系統等眾多多巴胺神經通路中，通過影響神經遞質的釋放以及釋放頻率等來調節神經元的興奮性[17]，與PD緊密相關。以往研究發現，DRD1和DRD2介導的多巴胺能信號對認知、運動和神經內分泌功能等具有重要影響，DRD3與思維、認知等功能相關[18]。本實驗通過qRT-PCR對杜仲抗PD機制進一步檢驗，與造模組相比，杜仲處理組斑馬魚drd1和drd2水平明顯上調，而drd3雖有上調趨勢，但無統計學意義，提示杜仲改善PD癥狀可能主要通過調節drd1和drd2發揮作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法，分析了杜仲有效成分，預測了杜仲抗PD的作用靶點，繪制了杜仲抗PD靶點的生物過程富集分析，通過斑馬魚行為學和體內實驗進行驗證，揭示杜仲可以緩解斑馬魚PD樣癥狀，并且與多巴胺能神經系統密切相關。這一發現為后續杜仲有效成分改善PD癥狀研究提供了新方向新思想。