微量動態顯色法與動態顯色法的等效性評價

裴宇盛，陳 晨，耿 穎，高 華，蔡 彤

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

細菌內毒素是注射劑中熱原污染的重要指標，在GMP生產條件下，無內毒素意味著無熱原[1]。細菌內毒素的質量控制方法為細菌內毒素檢查法，該方法是使用海洋生物鱟為原料而生產的專用試劑，在我國,近年來，由于環境惡化、過度捕撈等多種原因，我國的鱟資源已經表現出了迅速衰退的趨勢。在2019年，國際組織將中國鱟資源由原來的“缺乏數據”調整為“瀕危”級別[2]，到了2021年初，中國將中國鱟和圓尾蝎鱟列入國家二級保護動物名錄。鱟資源勢必收到嚴格的管控。而我國對鱟資源的需求卻逐年增多。因此，現有內毒素檢查法的補充替代方法的研究迫在眉睫。國內外有多種替代方法，如重組C因子法和單核細胞活化反應檢查法以及微量鱟試劑法。前兩種方法已經被中國藥典2020年版9251指南和9301指南收錄，并且這兩種方法已經有較多研究。微量鱟試劑法是國內為了應對鱟資源減少而研發的一類方法，目前已經出現微量凝膠法和微量動態顯色法。本研究聚焦于微量動態顯色法(micro kinetic chromogenic assay, mKCA)，該方法在不改變試驗原理的情況下，試驗操作與經典方法相同，僅鱟試劑的使用量減少為原方法的1/4。本研究采用微量動態顯色法與經典動態顯色法(kinetic chromogenic assay, KCA)進行比對研究，通過在國內多個實驗室進行協作研究，并采用多種統計方法對兩種方法進行比較評價。評價兩種方法的等效性，為方法替代提供數據支持。以達到減少鱟資源消耗，提高鱟試劑使用效率，間接保護鱟資源的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑Multiskan FC/ET型酶標儀(美國Thermo Scientific公司)。Robot 100型全自動細菌內毒素檢測系統(湛江安度斯生物有限公司)。細菌內毒素國家標準品(貨號150800-201601)，產自中國食品藥品檢定研究院。動態顯色法鱟試劑(貨號10-0.01 EU·mL-1)，購自湛江安度斯生物有限公司；動態顯色法鱟試劑(貨號10～0.01 EU·mL-1，2.8 mL)，購買自廈門鱟試劑生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1檢測方法 采用動態濁度法鱟試劑，每孔樣品和鱟試劑加樣量25 μL，檢測波長405 nm，預設OD值0.03。

1.2.2標準曲線的制備 用內毒素檢查用水稀釋內毒素國家標準品制備濃度為5、0.5、0.05、0.005 EU·mL-1的標準曲線，采用半孔酶標板(安度斯)，96空板(安度斯)分別進行檢測，每組重復3次。

1.2.3替代方法研究 用注射用水稀釋細菌內毒素國家標準品制備3.16、0.316和0.0316 EU·mL-1溶液。同時采用動態濁度法和微量動態濁度法進行檢測，為了評價不同廠家來源的鱟試劑(以A廠家和B廠家代稱)對檢測結果的影響，試驗參照精密度和準確度試驗[3]，采用2個廠家鱟試劑，3個不同濃度，每個廠家的鱟試劑檢測重復3次，在4家實驗室同時進重現性驗證。

1.2.4統計方法 使用JMP13軟件對結果進行統計分析，采用單因素方差分析，對各個實驗室之間的差異是否具有顯著性。采用配對t檢驗對替代方法進行評價。采取F雙邊檢驗對方差齊性，采取方法welch檢驗方差均值。采用等效性以兩家試劑動態顯色法各自為參考方法，微量動態法為比對方法對兩種方法的等效性進行檢驗。

2 結果

2.1 替代方法的單因素方差分析單因素方差分析結果見Tab 1。單因素方差分析的結果顯示，使用兩個廠家的鱟試劑(A和B)的各自參考方法和替代方法差異并沒有顯著性，表明就A和B單獨來看，各個實驗室之間、各個濃度組之間以及參考方法之間均沒有差異。但是A和B的參考方法的單因素方差分析具有顯著性則說明兩個廠家之間的差異有顯著性。

Tab 1 Results of One way ANOVA (n=36)

2.2 配對t檢驗配對t檢驗的結果與單因素方差分析的結果類似，結合單因素方差分析的結果來看，表明了就A試劑和B試劑單獨來看，兩種方法之間的差異無顯著性。但是A試劑和B試劑的參考方法的具有顯著性。見Tab 2。

Tab 2 Results of t test(n=36)

2.3 方差齊性檢驗在方差齊性方面，A廠家試劑顯示出差異有顯著性，表明使用微量法檢測數據結果的離散程度比參考方法大，進一步評價方差采用Welch檢驗評價方差均值的差異顯著性。該檢驗即使對于方差不齊的結果仍然可以進行比較。檢驗結果顯示A和B兩個廠家的試劑的方差均值差異無顯著性。F檢驗和Welch檢驗結果見Tab 3。

Tab 3 Results of F test and Welch test(n=36)

2.4 等效性檢驗等效性檢驗在進行比較時，需要設定指定的實際差值閾值，該數值越大對比較的兩種方法差異的容忍程度越大。當閾值為10的情況下，A和B試劑各自的參考方法和替代方法之間即等效。而A和B試劑的參考方法之間是不等效的。在日常檢測實踐中，A和B廠家的參考方法即目前國內細菌內毒素檢查法動態顯色法的經典方法。從藥典的合規性來說兩種方法均為法定檢測方法，其檢測結果應視為等效。因此，研究決定調整閾值直到A試劑和B試劑的參考方法之間為等效。經過計算，指定的實際差值閾值為20時，無論A試劑和B試劑參考方法之間，還是A試劑和B試劑各自參考方法和替代方法之間，均為等效。等效性檢驗結果見Tab 4。

Tab 4 Results of equivalence test(n=36)

3 討論

在兩種方法的比對評價過程中，采用了多種統計方法來評價，主要考慮內毒素檢測屬于生物測定法，更接近動物試驗，應使用等效性檢驗。單因素方差分析、配對t檢驗和等效性檢驗的結果較為一致，均顯示出不同廠家的現有動態顯色法之間存在一定差異而每個廠家的試劑采用微量或常規的量之間并不存在顯著性差異。這表明在動態顯色法方面，影響結果的主要因素是不同來源的鱟試劑，而非鱟試劑的使用量。值的注意的是，兩個廠家的試劑使用參考方法在t檢驗中表現出了差異顯著性以及在等效性檢驗閾值設置為10時表現出不等效，說明了我國這倆家試劑目前采用藥典方法即存在一定差異。關于此問題，國內外鮮有報道。這也表明了細菌內毒素檢查法本身就具有較大誤差，其作為一種生物檢定方法的具有一定特殊性。為了減少人員稀釋過程的誤差，本研究采用了全自動內毒素稀釋系統。最大程度的減少了除了試劑引入的誤差，從而更加真實準確的評價替代方法。

《中國藥典》2020年版規定，供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的加樣比例以及保溫時間等，參照所用的儀器和試劑的有關說明進行。即鱟試劑的加樣量并非僅有傳統的0.1 mL裝量。但對于國內普遍采用0.1 mL檢驗體系已經多年，因此必須對微量動態顯色法進行方法等效性方面的研究。

綜上所述，本研究首次開展了微量動態顯色法與動態顯色法之間的一致性研究，表明微量動態顯色法在準確度回收率方面是與現有試劑等效的。由于細菌內毒素檢查法屬于生物測定法，目前藥典中尚無專門針對生物活性為機制的雜質測定方法的方法評價指南，隨著內毒素檢測應用的不斷拓展[4-10]，必將有更多的替代方法和研究需要進行方法的等效性研究，本研究為此類方法替代方法研究提供一定參考。