基于雙五氟芐基硫醚的氣相色譜-質譜法測定大鼠腦組織中的H2S

王 秀，汪 生，陳志武

(安徽醫科大學 1.基礎醫學院藥理教研室，2.科研實驗中心，安徽 合肥 230032)

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)被認為是繼一氧化碳(carbon monoxide，CO)和一氧化氮(nitric oxide，NO)之后發現的第三種內源性氣體信號分子[1]，多年的科學研究揭示腦組織中存在生理濃度的H2S，并參與了心血管系統和神經系統等機體的生理功能調節和病理過程。內源性H2S主要由酶促反應產生，可通過胱硫醚-β-合成酶(l-cystathionine-β-synthetase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(l-cystathionine-γ-lyase，CSE)催化半胱氨酸(l-cysteine，L-Cys)生成。另外，3-巰基丙酮酸硫基轉移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)也可生成H2S[2]。腦組織中含有豐富的H2S合酶，如CBS和3-MST，產生的H2S可起到神經遞質或神經調質的作用，發揮多種生物學效應，如促進海馬長時程增強而參與學習和記憶功能的調劑，抑制神經炎癥反應[3-4]，通過抗氧化應激損傷和抗細胞凋亡等產生較強的神經保護作用[4-6]。

在H2S的神經生物學作用研究中，腦組織中H2S的檢測是至關重要的。目前，測定生物樣品中H2S濃度的方法主要有亞甲基藍分光光度法[7]、頂空氣相色譜法[8]、反相高效液相色譜法[9]和熒光探針法[10]。其中，亞甲基藍法簡單快速，是檢測水和非生物性樣品中H2S濃度的最常用的方法。但其敏感性較差，且實驗過程中生成了其他的有色物質，可能對665 nm處檢測的吸收峰產生影響，使測定結果產生誤差；頂空氣相色譜法實驗不成熟，難以用于實踐；反相高效液相色譜法的準確性易受到氧濃度的影響，定量分析有一定難度；熒光探針法具有較高的靈敏度和選擇性，但其穩定性低且成本過高。Kage等[11]報道在堿性條件下，將血液中H2S轉化為硫離子(S2-)后，用五氟卞基溴(pentafluorobenzyl bromide，PFBBr)衍生化成雙五氟芐基硫醚(bispentafluorobenzyl sulfide，C6F5CH2SCH2C6F5)，采用氣相色譜-質譜法(gas chr-omatograph-mass spectrometry，GC-MS)檢測C6F5CH2SCH2C6F5來確定H2S濃度。目前認為該方法敏感性和特異性均較好，是檢測血液樣本中H2S的金標準[12]。由于蛋白質中含硫的氨基酸也可產生釋放S2-，并且腦組織比血液含有更多的蛋白質，該方法能否檢測腦組織中H2S尚未見文獻研究報道。因此，本研究優化了腦組織樣品的前處理和PFBBr衍生化反應的條件，建立腦組織中H2S的GC-MS測定方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1儀器 安捷倫7890B-7000D型氣相色譜三重四極桿質譜儀，由美國Agilent公司出品；XW-80C型旋渦混合器，上海醫科大學儀器廠出品；XPE205型分析天平，瑞士ETTLER TOLEDO公司出品；Milli-Q Integral型超純水系統，由美國Millipore公司出品。

1.1.2藥品與試劑 硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)、甲醇(methanol，HPLC級，純度≥99.9%)，購自美國Sigma公司，批號分別為#SHBL6872V和#WXBD4144V；四硼酸鈉(sodium tetraborate，Na2B4O7, 純度>99.5%)，購自上海麥克林生化科技有限公司，批號：L11197038；五氟卞基溴(pentafluorobenzyl bromide，PFBBr, 純度為98%)、十四烷基二甲基芐基氯化銨(tetradecyl dimethyl benzyl ammoniumchloride，TDMBA, 純度為99%)和1,3,5-三溴苯(1,3,5-tribromobenzene, TBB, 純度>98%)，均購自中國百靈威科技有限公司，批號分別為L950U31、L360U66和L9A0T55；磷酸二氫鉀(potassium dihydrogen phosphate，KH2PO4, 純度≥99.5%)、乙酸乙酯(HPLC級, 純度≥99.8%)購自國藥集團化學試劑有限公司，批號分別為20181209和20200617。

1.1.3實驗動物 健康SD大鼠(SPF級)，160～200 g，全部由安徽醫科大學實驗動物中心提供。實驗室內通風良好，飼養溫度為(22±3) ℃。實驗所用動物生產許可證號為：SCXK(皖)2017-001。

1.2 GC-MS測定方法

1.2.1溶液配制 飽和Na2B4O7溶液：稱取1.5 g Na2B4O7，加入到250 mL無氧水中(超純水煮沸10 min，冷卻至室溫)，加熱溶解，冷卻至室溫后超聲，取上層清澈溶液。TDMBA溶液：稱取TDMBA 92.0 mg，加入50 mL飽和Na2B4O7溶液中溶解。NaHS標準品溶液：稱取NaHS標準品56.0 mg，加入1 mL飽和Na2B4O7溶液溶解后，稀釋成適當濃度的標準溶液(現配現用)。PFBBr溶液：稱取PFBBr 104.4 mg，加入40 mL乙酸乙酯溶解。內標TBB溶液：稱取TBB 8.0 mg，加入10 mL乙酸乙酯，溶解后得到800 μg·L-1的溶液，臨用時稀釋成4 μg·L-1。飽和KH2PO4：稱取11.0 g KH2PO4，加入到50 mL無氧水中，加熱溶解，冷卻至室溫后超聲，取上層無晶體溶液。

1.2.2測定原理 在堿性條件下，H2S轉化為HS-后，被PFBBr衍生化生成C6F5CH2SCH2C6F5。通過氣相色譜分離和質譜定性后，用C6F5CH2SCH2C6F5的選擇離子質荷比(m/z)與TBB的選擇離子質荷比(m/z)的峰面積比定量分析。

1.2.3色譜條件 采用HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)毛細管柱；色譜柱程序升溫：起始溫度為100 ℃，保持1.5 min后，以40 ℃·min-1上升到280 ℃，保持5 min；進樣口溫度為280 ℃；載氣為氦氣，速度為1.0 mL·min-1；分流比為10 ∶1；進樣量0.5 μL。

1.2.4質譜條件 電子轟擊離子源，電子能量20 eV。離子源溫度為230 ℃，接口溫度為280 ℃，四極桿溫度為150 ℃，采用MRM模式。內標TBB的一級母離子是314(m/z)，定量離子對為m/z 314→235，定性離子對為m/z 207→191。目標衍生物C6F5CH2SCH2C6F5的一級母離子是394(m/z)，定量離子對為m/z 394→181，定性離子對為m/z 181→161。

1.2.5腦組織樣品的處理和衍生化反應 大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，斷頭取腦，稱取0.1 g雙側大腦皮質組織浸入0.9 mL飽和Na2B4O7溶液中勻漿90 s。吸取200 μL腦組織勻漿液，加入1倍量甲醇沉淀蛋白，震蕩混勻1 min，離心10 min(12 000 r·min-1,4 ℃)。

取300 μL離心的上清液加入到玻璃試管中，依次加入0.8 mL TDMBA溶液、0.5 mL PFBBr溶液和1.0 mL TBB溶液，震蕩混勻2 min。置搖床(250 r·min-1，25 ℃)中反應1 h，加入1.0 mL飽和KH2PO4溶液，震蕩混勻1 min，吸取上層有機相離心10 min(12 000 r·min-1)，過0.22 μm有機微孔濾膜，以待進行后續的GC-MS檢測。

1.2.6方法學驗證 在預實驗確定的最佳實驗條件下，依據《中華人民共和國藥典》關于分析方法驗證指導原則進行方法學驗證，分別考察GC-MS測定H2S方法的選擇性、線性關系與檢測限、準確度與精密度、回收率、基質效應以及穩定性等。

1.3 大鼠NaHS給藥后，腦組織中H2S濃度的測定將SD大鼠按隨機原則分為4組，即生理鹽水(NS)對照組、NaHS 1.4、2.8和5.6 mg·kg-13個劑量組，每組6只大鼠，雌雄各半。各組大鼠分別尾靜脈注射NS或各劑量NaHS，0.5 h后，斷頭取腦，分離雙側腦皮質組織并按“1.2.5 腦組織樣品的處理和衍生化反應”方法處理后，待GC-MS檢測。

2 結果

2.1 色譜分離和質譜定性

2.1.1色譜分離 取64 μmol·L-1的NaHS標準品溶液和NaHS終濃度為64 μmol·L-1的大鼠腦勻漿各200 μL，按前述方法經PFBBr衍生化后，進行GC-MS檢測分析。如Fig 1所示，NaHS標準品溶液和加NaHS的大鼠腦勻漿中TBB波峰和C6F5CH2SCH2C6F5波峰的峰形良好，內標出峰時間均為4.8 min，C6F5CH2SCH2C6F5出峰時間均為5.4 min。

Fig 1 Chromatogram of TBB and C6F5CH2SCH2C6F5TBB was used as internal control. Retention time was 4.8 min for TBB and 5.4 min for C6F5CH2SCH2C6F5. A: 64 μmol·L-1 NaHS standard solution; B: Rat brain homogenate spiked with NaHS at a final concentration of 64 μmol·L-1.

2.1.2質譜定性 如Fig 2所示，TBB特征離子有m/z 314和m/z 235，C6F5CH2SCH2C6F5特征離子有m/z 394和m/z 181。參考文獻的方法[13]，選擇m/z 314→235子離子對定量測定TBB和m/z 394→181子離子對定量測定C6F5CH2SCH2C6F5。

Fig 2 Mass spectra of TBB and C6F5CH2SCH2C6F5TBB was used as internal control. A: TBB; B: C6F5CH2SCH2C6F5

2.2 衍生化反應條件的優化

2.2.1PFBBr濃度 配制1、5、10和20 mmol·L-1的PFBBr系列濃度溶液，分別與含100 μmol·L-1NaHS的腦勻漿液衍生化反應后進行GC-MS檢測分析。結果如Fig 3A所示，PFBBr濃度在1～10 mmol·L-1范圍內時，C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比隨PFBBr濃度增加而增大(P<0.01)。加入20 mmol·L-1PFBBr溶液進行衍生化反應時，峰面積比略有減小，但無統計學意義。因此，本文后續實驗的衍生化反應采用10 mmol·L-1的PFBBr。

Fig 3 Optimization of derivatization reaction n=3)A: PFBBr concentration (**P<0.01 vs 10 mmol·L-1); B: Temperature of derivatization reaction(*P<0.05 vs 25 ℃); C: Time of derivatization reaction.(*P<0.05 vs 60 min).

2.2.2衍生化反應溫度和時間 為確定衍生化反應的最佳溫度，將10 mmol·L-1的PFBBr加入含100 μmol·L-1NaHS的腦勻漿液中分別置25、35和45 ℃ 3個溫度下進行60 min的衍生化反應后進行GC-MS檢測分析。Fig 3B顯示，25 ℃時C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比最大，35 ℃時的峰面積比與25 ℃時的相比略有減小，但差異無統計學意義。45 ℃時的峰面積比與25 ℃時的相比明顯減小(P<0.05)。

將10 mmol·L-1的PFBBr加入含100 μmol·L-1NaHS的腦勻漿液中于25 ℃下分別反應30、60和120 min后進行GC-MS檢測分析。Fig 3C表明反應進行60 min時，C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比最大。衍生化反應30 min與反應60 min相比，峰面積比明顯減小(P<0.05)。衍生化反應120 min與反應60 min相比，峰面積比差異無統計學意義。因此，本文后續實驗在25 ℃中進行60 min的衍生化反應。

2.3 方法學驗證

2.3.1水溶液中H2S的測定

2.3.1.1 選擇性 分別取不加內標TBB的飽和Na2B4O7溶液(用乙酸乙酯代替TBB)、加TBB的飽和Na2B4O7溶液和加TBB的64 μmol·L-1NaHS標準品溶液各200 μL，衍生化反應后進行GC-MS檢測分析。Fig 4色譜圖顯示，加TBB的飽和Na2B4O7溶液和NaHS標準品溶液均出現了明顯的TBB特征波峰，NaHS標準品溶液出現了明顯的C6F5CH2SCH2C6F5波峰，TBB與C6F5CH2SCH2C6F5的保留時間分別為4.8 min和5.4 min，兩者分離完全，峰形良好。不加TBB的飽和Na2B4O7溶液既未出現TBB波峰，也未出現C6F5CH2SCH2C6F5波峰。結果表明本方法對H2S的測定具有明顯的選擇性。

Fig 4 Selectivity of method for detecting H2S in aqueous solution(GC-MS method)Peak at 4.8 min was for internal control TBB and peak 5.4 min was for C6F5CH2SCH2C6F5. A: Chromatogram of Na2B4O7 solution without TBB; B: Chromatogram of Na2B4O7 solution with TBB; C: Chromatogram of 64 μmol·L-1 NaHS standard solution with TBB.

2.3.1.2 線性關系與檢測限 配制濃度分別為1、10、25、50、75和100 μmol·L-1的NaHS標準品溶液，按“1.2.5”項下處理后進行GC-MS檢測。以NaHS的濃度為自變量(x)，測得的C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比為因變量(y)做線性回歸分析。得到回歸方程為Y=0.02169X-0.0015(R2=0.9995)，線性范圍為1～100 μmol·L-1。按信噪比S/N≥3，測得本方法檢測限(limit of detection，LOD)為0.3 μmol·L-1。

2.3.1.3 準確度與精密度 配制濃度分別為10、50和100 μmol·L-1的NaHS標準品溶液，每個濃度平行6個樣品，連續測定3 d。根據當日隨行標曲，計算得到各樣品濃度。參照標示濃度，利用公式可得準確度和日內、日間精密度。如Tab 1所示，該方法的準確度為-1.41～5.82，日內、日間精密度均<15%，表明本方法測定水溶液中H2S具有良好的準確度和精密度。

Tab 1 Accuracy and precision of method for detecting H2S in aqueous solution and rat brain tissues(n=6)

2.3.1.4 穩定性 配制10、50和100 μmol·L-1的NaHS標準溶液樣品，每一濃度平行3個樣品，分別考察NaHS標準品溶液在室溫25 ℃下保存24 h和衍生化產物C6F5CH2SCH2C6F5在室溫25 ℃下保存24 h時的穩定性。如Tab 2結果顯示，NaHS溶液的穩定性為44.08%～64.43%，其穩定性不好。C6F5CH2SCH2C6F5的穩定性為93.41%～98.66%，且RSD<15%，表明C6F5CH2SCH2C6F5在室溫下具有良好的穩定性。

Tab 2 Stability of method for detecting H2S in aqueous solution(n=3)

2.3.2大鼠腦組織中H2S的測定

2.3.2.1 選擇性 分別取空白大鼠腦勻漿液、空白大鼠腦勻漿液(樣品處理過程中不加甲醇沉淀蛋白)和NaHS終濃度為64 μmol·L-1的大鼠腦勻漿液各200 μL，按上述優化條件衍生化反應后進行GC-MS檢測。Fig 5顯示3組樣品中均出現了C6F5CH2SCH2C6F5波峰，未加甲醇的腦勻漿樣品中C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比明顯地大于加甲醇的腦勻漿樣品(P<0.01)，加NaHS的腦勻漿樣品中C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比也明顯地大于加甲醇的腦勻漿樣品(P<0.01)。結果表明該方法對測定腦組織中的H2S有明顯的選擇。

Fig 5 Selectivity of method for detecting H2S in rat brain tissue(GC-MS method)Peak at 4.8 min was for internal control TBB and peak 5.4 min was for C6F5CH2SCH2C6F5. A: Chromatogram of blank rat brain homogenate(with methanol); B: Chromatogram of blank rat brain homogenate(without methanol) ; C: Chromatogram of rat brain homogenate spiked with NaHS at a final concentration of 64 μmol·L-1 (with methanol); D: Differences of peak area ratio of C6F5CH2SCH2C6F5 to TBB between blank rat brain homogenate , undeproteinized blank rat brain homogenate and the rat brain homogenate spiked with NaHS at a final concentration of 64 μmol·L-1 n=3). **P<0.01 vs the blank+methanol group.

2.3.2.2 線性關系與檢測限 在空白大鼠腦勻漿液中加入NaHS標準品溶液，配制NaHS終濃度分別為0.25、1、4、16、64、256 μmol·L-1的系列腦組織樣品，衍生化反應后進行GC-MS分析。以NaHS終濃度為自變量(x)，加入NaHS后增加的C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比為因變量(y)，進行線性回歸分析。得回歸方程為y=0.021 11x+0.002 5(R2=0.999)，線性范圍為0.25～256 μmol·L-1。按信噪比S/N≥3，測得本方法檢測限(limit of detection，LOD)為0.1 μmol·L-1。

2.3.2.3 準確度與精密度 配制NaHS終濃度分別為16、64和256 μmol·L-1的腦勻漿樣品，每個濃度平行配制6個樣品，連續測定3 d。根據當日隨行標曲，計算得到各樣品濃度。參照標示濃度，利用公式可得準確度和日內、日間精密度。如Tab 1所示，準確度為-7.27～4.20，日內、日間精密度均<15%。結果表明該方法測定腦組織中H2S也具有良好的準確度和精密度。

2.3.2.4 回收率 以加入NaHS標準品后腦組織勻漿液中增加的C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比，按照上述線性回歸方程計算回收率。結果如Tab 3所示，含NaHS 16、64和256 μmol·L-1的腦組織樣品的測定回收率均在90%以上，表明該方法測定的回收率良好。

Tab 3 Recovery, matrix effect and stability of method for detecting H2S in rat brain tissues

2.3.2.5 基質效應 配制NaHS終濃度分別為16、64和256 μmol·L-1的腦勻漿樣品，每個濃度平行配制6個樣品，測得加入NaHS后增加的C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比為A1。另用飽和Na2B4O7溶液配制NaHS濃度為16、64和256 μmol·L-1樣品，每個濃度平行配制3個樣品，計算得各濃度C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比均數為A2。按公式M=A1/A2×100%計算基質效應M。如Tab 3所示，該方法測得M在93.12%～97.63%之間，表明本方法無明顯的基質效應。

2.3.2.6 穩定性 配制NaHS終濃度分別為16、64和256 μmol·L-1的腦勻漿樣品，每個濃度平行配制3個樣品，衍生化反應后立即進行GC-MS檢測分析，得到C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比。將反應產物于室溫25 ℃放置24 h后，再次測定峰面積比，計算其穩定性。結果如Tab 3所示，3個濃度的NaHS腦組織樣品的衍生化產物在室溫25 ℃保存24 h的穩定性在93.49%～97.15%之間，表明該方法測定在常溫下較為穩定。

2.4 靜脈注射NaHS對大鼠腦皮質組織中H2S濃度的影響本實驗中大鼠腦皮質組織中基礎H2S濃度通過測定NS組大鼠腦皮質組織C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比，根據NaHS標準品溶液制備的標準曲線求得。結果如Fig 6所示，大鼠腦組織中基礎H2S濃度為(11.84±0.38) μmol·L-1。靜脈注射1.4、2.8和5.6 mg·kg-1NaHS后，腦組織中的H2S濃度呈劑量依賴性增加，2.8 mg·kg-1與5.6 mg·kg-1組大鼠腦組織中的H2S濃度與NS對照組相比有顯著性差異。結果表明外源性H2S可透過血腦屏障進入腦組織。

Fig 6 Effect of intravenous injection of NaHS on H2S concentration in rat brain n=6)**P<0.01 vs NS.

3 討論

H2S為多種細胞產生、釋放的內源性氣體[1]，可參與調節體內許多生理功能和一些病理過程。當pH為7.4時，體液中的H2S約40%以氣體形式存在，60%以HS-形式存在，但pH為9.5時，主要以HS-形式存在[14]。弱堿性的飽和Na2B4O7溶液不僅可促進H2S轉化成HS-，還可提供HS-與PFBBr衍生化反應所需的堿性環境[15]。衍生化反應生成的硫衍生物C6F5CH2SCH2C6F5熱穩定、揮發性強、具有強電子捕獲性，適用于GC-MS法檢測H2S。

在GC-MS法檢測C6F5CH2SCH2C6F5來定量腦組織H2S中，HS-與PFBBr的衍生化反應條件是十分重要的。本研究對衍生化反應中PFBBr的濃度、反應的時間和溫度進行了優化，發現衍生化反應中的PFBBr最適濃度為10 mmol·L-1，最適反應時間和反應溫度分別為60 min和25 ℃。

本研究對C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法檢測水溶液和大鼠腦組織中H2S的方法學均進行了研究。研究結果表明該方法不僅對水溶液中H2S的檢測具有明顯的選擇性、良好的準確度和精密度，對大鼠腦組織中H2S的檢測也同樣具有選擇性和良好的準確度、精密度。本文在實驗中觀察到，未加甲醇沉淀蛋白的空白大鼠腦組織中C6F5CH2SCH2C6F5與TBB峰面積比明顯地大于加甲醇的空白大鼠腦組織樣品(P<0.01)。可能是由于腦組織中含有大量的蛋白質，蛋白質中含硫的氨基酸釋放S2-，使測定的峰面積比增加。因此，腦組織樣品處理時應加入甲醇沉淀蛋白，盡可能減小蛋白質的S2-對H2S測定產生影響。文獻報道大鼠腦組織中H2S的濃度在幾十到一百多微摩爾每升，該方法檢測腦組織中H2S的線性范圍為0.25～256 μmol·L-1，LOD為0.1 μmol·L-1，并且不存在明顯的基質效應，可滿足腦組織中H2S的檢測。因此，C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法是檢測腦組織中H2S的一種可靠、有效的方法。

在該方法檢測腦組織中H2S的穩定性研究中，將樣品H2S衍生成C6F5CH2SCH2C6F5后在室溫25 ℃下保存24 h，檢測穩定性良好。在水溶液中H2S檢測穩定性研究中，觀察到樣品衍生化生成的C6F5CH2SCH2C6F5在室溫25 ℃下保存24 h，檢測也具有良好的穩定性。但樣品直接在25 ℃下保存24 h，則檢測穩定性較差，這可能與C6F5CH2SCH2C6F5穩定性好，而樣品H2S易于揮發溢出有關[16]。因此，應用C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法檢測H2S時，應在采樣后盡快或衍生反應完成24 h內完成檢測，可減少因H2S揮發導致的影響。

本文采用了C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法檢測了大鼠腦組織中H2S。檢測結果表明健康SD大鼠腦皮質組織中基礎H2S濃度約為(11.84±0.38) μmol·L-1，明顯低于文獻報道的亞甲基藍法測定的大鼠腦內H2S濃度在50～160 μmol·L-1范圍[17]。是否由于亞甲基藍法在665 nm處檢測H2S時，易受到其它物質的干擾，造成檢測值偏高，而C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法檢測H2S具有良好的選擇性，前處理時去除了大部分蛋白，更接近體內H2S真實濃度，當然這還有待于今后進一步的研究證實。同時，本文也觀察到靜脈注射NaHS后，大鼠腦皮質組織中的H2S濃度呈劑量依賴性增加，這不僅驗證了C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法可以檢測腦組織中H2S，也表明外源性H2S可透過血腦屏障進入腦組織。

綜上所述，本文成功建立了C6F5CH2SCH2C6F5的GC-MS法檢測腦組織中H2S的方法，為腦組織中H2S的定量測定提供了一個可靠、有效的方法，并證明外源性H2S可透過血腦屏障進入腦組織。