糖尿病腎病患者血清LncRNA H19、YKL-40表達及臨床意義

陳燁 王昱 喻海燕 賈崇高 顏潤 (貴州醫科大學附屬醫院腎內科，貴州 貴陽 550004)

糖尿病腎病(DN)是2型糖尿病的并發癥之一，由于其早期發病較為隱匿導致患者確診時已處于進展期，隨著疾病的發展可最終形成終末期腎病從而降低治療效果，患者5年生存率較低〔1～3〕。因而早期診斷及治療DN具有重要意義。長鏈非編碼RNA(LncRNA)表達異常可參與DN等多種疾病發生及發展過程，但LncRNA在DN發生及發展過程中的作用機制尚未完全闡明〔4〕。LncRNA H19在糖尿病性心肌病中的表達下調，上調其表達可抑制心肌細胞凋亡〔5〕。但LncRNA H19在DN患者血清中的表達及其臨床意義尚未闡明。幾丁質酶-3樣蛋白-1(YKL-40)是一種炎性蛋白，其可在冠心病、糖尿病動脈粥樣硬化等過程中表達上調，并可能參與多種炎癥性疾病發生及發展過程〔6〕。因此，本研究主要探討DN患者血清LncRNA H19、YKL-40的表達水平，探究LncRNA H19與YKL-40及患者生化指標的相關性，為DN的診斷及治療提供潛在的生物學標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年2月至2018年5月貴州醫科大學附屬醫院收治的80例2型糖尿病患者為研究對象，患者均符合2型糖尿病診斷標準〔7〕，根據DN診斷標準將患者分為無DN組(22例)與DN組(58例)〔8〕。根據尿微量白蛋白、腎功能、肌酐水平將DN患者分為DN 3期25例，DN 4期19例，DN 5期14例〔9〕。無DN組中男12例、女10例，平均年齡(52.32±7.59)歲。DN組中男34例、女24例，平均年齡(51.32±8.75)歲。同時選取醫院體檢中心的健康志愿者30例為對照組，其中男16例、女14例，平均年齡(50.23±6.25)歲。各組年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者知情且簽署同意書。

1.2方法

1.2.1采集血液樣本 研究對象均于清晨分別抽取空腹靜脈血5 ml，4℃條件下3 000 r/min離心10 min，分離血清置于-20℃冰箱內保存。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測LncRNA H19的表達水平 采用Trizol法提取血清中的總RNA，應用紫外分光光度計測定RNA濃度。參照反轉錄試劑盒將總RNA合成cDNA。以cDNA為模板進行qRT-PCR，反應條件為：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環40次。LncRNA H19正向引物5′-TCCTGAACACCTTAGGCTGG-3′，反向引物5′-TTCACCTTCAGAGC CGATT-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATG GTGATGGGATT-3′，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。Trizol試劑、反轉錄與實時熒光定量PCR試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司。LncRNA H19以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算LncRNA H19相對表達量。

1.2.3酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測YKL-40的水平 采用ELISA檢測血清YKL-40的水平，檢測試劑盒購自美國Quidel公司，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

1.2.4觀察指標 應用cobas c311型全自動生化分析儀(美國羅氏公司)檢測血尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)的水平。應用i2000型電化學發光全自動免疫分析儀檢測血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、同型半胱氨酸(Hcy)。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、χ2檢驗、Pearson分析。

2 結 果

2.13組BMI、BUN、CREA及血清LncRNA H19、YKL-40水平比較 與對照組和無DN組比較，DN組BUN、CREA水平均升高，差異有統計學意義(P<0.05)，3組BMI比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.23組血清LncRNA H19、YKL-40水平比較 與對照組比較，無DN組、DN組血清LncRNA H19表達水平顯著降低(P<0.05)，YKL-40水平顯著升高(P<0.05)；與無DN組比較，DN組血清LncRNA H19表達水平顯著降低(P<0.05)，YKL-40水平顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組BMI、BUN、CREA及血清LncRNA H19、YKL-40水平比較

2.3DN患者不同亞組血清LncRNA H19、YKL-40的水平比較 與DN 3期比較，DN 4期、DN 5期患者血清LncRNA H19表達水平顯著降低(P<0.05)，YKL-40水平顯著升高(P<0.05)；與DN 4期比較，DN 5期患者血清LncRNA H19表達水平顯著降低(P<0.05)，YKL-40水平顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 DN患者不同亞組血清LncRNA H19、YKL-40水平比較

2.43組生化指標水平比較 與對照組比較，無DN組、DN組TG、TC、LDL-C、Hcy水平顯著升高(P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)；與無DN組比較，DN組TG、TC、LDL-C、Hcy水平顯著升高(P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 3組生化指標水平比較

2.5DN患者血清LncRNA H19與YKL-40、TG、TC、LDL-C、HDL-C、Hcy的相關性分析 LncRNA H19與YKL-40、TG、TC、Hcy呈負相關(r=-0.855、-0.775、-0.377、-0.933；均P<0.05)與LDL-C、HDL-C無顯著相關性(r=0.141、-0.043，均P>0.05)。

3 討 論

LncRNA在DN患者血清中的表達及其可能作用機制等相關研究尚處于起步階段，深入探討LncRNA在DN發生及發展過程中的作用對提高DN早期診斷效率及治療效果具有重要意義，還可為闡釋DN發病機制提供理論基礎〔10〕。

LncRNA H19表達上調可抑制高血糖誘導的視網膜上皮細胞炎癥反應〔11〕。LncRNA H19還可抑制高血糖誘導的人靜脈內皮細胞炎癥反應〔12〕。LncRNA H19可抑制糖尿病性視網膜病變的發展進程〔13〕。LncRNA H19表達下調可促進高血糖癥的發生〔14〕。本研究結果提示LncRNA H19在DN發生及發展過程中可能發揮重要調控作用。本研究進一步分析發現隨著血清LncRNA H19的表達水平降低DN病情愈加嚴重。提示LncRNA H19可能作為判斷DN病情嚴重程度的重要生物學指標。

DN患者血清YKL-40水平升高，并可能是動脈粥樣硬化的危險因素之一〔15〕。血清YKL-40水平升高可增加2型糖尿病視網膜病變、DN的發生風險，其水平升高與疾病嚴重程度呈正相關〔16〕。YKL-40水平升高與2型糖尿病大血管病變發生及發展密切相關，并可能作為早期診斷2型糖尿病大血管病變的重要指標〔17〕。YKL-40水平升高還與腦梗死發生密切相關〔18〕。本研究結果與上述研究結果相似。本研究進一步分析提示YKL-40水平升高預示DN病情嚴重。本研究相關分析結果提示LncRNA H19表達水平降低可能促進炎癥反應的發生從而誘導機體代謝異常最終促進DN的發生及發展。

綜上所述，DN患者血清LncRNA H19表達水平降低，YKL-40水平升高，二者呈負相關且均可參與DN發生及發展過程，其可作為判斷疾病嚴重程度的重要生物學指標，可為DN治療提供新方向，并可為尋找DN診斷及評估疾病進展的生物學標志物的研究提供理論依據。但DN發生及發展的影響因素較為復雜，關于其具體的發病機制尚需深入探究。