川芎龍蛭湯對腦缺血損傷模型大鼠血清中TNF-α、Ang-1和VEGF水平影響及作用機制

孫錫萍 王念龍 劉天易 祝明浩

(1青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，山東 即墨 266200；2青島市即墨區(qū)人民醫(yī)院；3山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院)

腦缺血是腦血管常見疾病，指組織在一定時間缺血后組織受到損傷，使腦細胞產(chǎn)生炎性反應、能量障礙、凋亡基因激活等多種損傷，最終導致神經(jīng)元損傷〔1〕。炎癥反應可造成腦組織損傷，減少炎癥反應可能對腦缺血損傷疾病的治療及預后有積極影響，腫瘤壞死因子(TNF)-α具有多種免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白，可介導白細胞介素(IL)-6等多種炎癥細胞因子釋放，TNF-α高表達可加重腦缺血，抑制TNF-α因子合成、分泌及表達，可減輕缺血再灌注腦損傷〔2，3〕。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)為血管新生過程中調(diào)控因子，也是腦缺血后使血管再生的調(diào)控因子，可通過促進血管內(nèi)皮細胞分裂、增殖等促進血管新生。血管緊張素(Ang)-1具有強烈促增殖和分化作用，參與內(nèi)皮細胞遷移、增殖等多個環(huán)節(jié)調(diào)控新生血管，上調(diào)Ang-1表達可調(diào)控新生血管的重塑〔4，5〕。

腦缺血損傷屬中醫(yī)學“中風”范疇，是嚴重危害人類生活健康的主要疾病，西醫(yī)臨床治療以溶栓和神經(jīng)保護劑等為主，不良反應較重，成本高，不適合患者長期使用。中藥有效成分對各種疾病的預防和治療具有多環(huán)節(jié)和多靶點的優(yōu)勢，在減少腦缺血損傷方面也具有一定優(yōu)勢〔6〕。川芎龍蛭湯為青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院在《壽世保元》卷五活血湯的基礎上，加減化裁形成的院內(nèi)協(xié)定方，對腦卒中類疾病具有較好的臨床療效，但其作用機制尚不明確〔7，8〕。本研究探討川芎龍蛭湯對實驗性腦缺血損傷模型大鼠TNF-α、Ang-1和VEGF水平的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級SD大鼠，8周齡，體重(200±20)g，購自山東省實驗動物中心〔SCXK-(魯)2018-0001〕，室溫飼養(yǎng)，自由飲水，適應性飼養(yǎng)3 d后進行實驗。

1.2藥品、試劑及儀器 川芎龍蛭湯方藥組成：川芎10 g、地龍15 g、水蛭10 g、郁金10 g、石菖蒲15 g、膽南星10 g、生黃芪20 g、制首烏15 g、鉤藤10 g、仙靈脾10 g、枸杞子10 g、女貞子10 g、丹參20 g、全蝎10 g、僵蠶10 g。上述中藥飲片由青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，藥材加水煎煮2次，分別濃縮至含0.5、1.0、1.5 g/ml原藥材的藥液，作為川芎龍蛭湯低、中、高劑量組。芪蛭通絡膠囊(0.5 g/粒，山西振東制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：20181213)，尼龍線栓購自北京沙東生物技術(shù)有限公司，水合氯醛購自國藥集團化學試劑有限公司，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒和2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色購自武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司(批號分別為：AS1055A、AS1055B和AS1095)，TNF-α、Ang-1和VEGF試劑盒購自碧云天生物科技有限公司(批號分別為：J190064、J190007和J180079)，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(碧云天生物科技有限公司，批號分別為：201903171、201903115)，Trizol提取試劑盒購自TaKaRa公司(批號：AKA5101)，實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)試劑盒購自BIO-RAD公司(批號：L001751A)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司(批號：AK4102)，TNF-α、Ang-1、VEGF和GAPDH引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司，聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自Millipore公司(批號：K5EA5859N)，山羊抗兔IgG購自Abcam公司(批號：150077)，TNF-α、Ang-1、VEGF單抗購自武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司(批號分別為bs-4617R、bs-0920R和bs-0167R)。實驗儀器：手術(shù)器械(蘇州六六視覺醫(yī)療設備公司)，BX60顯微鏡(日本Olympus Optical公司)，ELx800酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)，電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀〔伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司〕,SIM凝膠成像儀(美國西盟生命技術(shù)有限公司),反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR擴增分析系統(tǒng)(美國羅氏公司)。

1.3模型建立及分組 將60雄性SD大鼠用5%水合氯醛麻醉，隨機分為對照組、模型組和川芎龍蛭湯低、中、高劑量組和陽性組各10只。除對照組外，其他5組采用改良閉塞線栓法栓塞大腦中動脈建立實驗性腦缺血損傷大鼠模型〔9〕，去除大鼠右側(cè)背部被毛，仰臥四肢固定于手術(shù)臺板，頸部正中區(qū)域做豎切口，鈍性分離雙側(cè)筋膜及腺體，充分暴露右側(cè)頸動脈，顯微鑷分離頸外動脈和頸內(nèi)動脈，靠近分叉處結(jié)扎頸外動脈，距右側(cè)頸總動脈分叉近端絲線結(jié)扎，在右側(cè)頸總動脈遠端置絲線打一活結(jié)備用，逐層縫合筋膜和皮膚，切口用碘伏常規(guī)消毒。對照組除不插入線栓外，其余手術(shù)過程相同。

1.4給藥方法 于造模24 h后進行干預。對照組和模型組給予生理鹽水灌胃，川芎龍蛭湯低、中、高劑量組給予不同濃度的川芎龍蛭湯灌胃，劑量均為10 ml/kg，1次/d，給藥7 d。陽性組給予芪蛭通絡膠囊，取芪蛭通絡膠囊內(nèi)容物制成0.1 g/ml的藥液，灌胃劑量為1.0 g/kg，1次/d，給藥7 d。

1.5神經(jīng)功能損傷程度 末次給藥24 h后評價神經(jīng)功能損傷程度，采用5級評分法〔10〕，無神經(jīng)功能缺損癥為0分；提尾懸空時對側(cè)前爪不能伸展為1分；行走時出現(xiàn)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；行走時出現(xiàn)困難且向左側(cè)傾倒為3分；無自主活動且伴意識喪失為4分。

1.6腦梗死面積 采用TTC染色測定大腦梗死面積，腦片平鋪于2%TTC染色液中，避光孵育0.5 h，腦片用10%甲醛固定，梗死組織呈白色，正常腦組織呈紅色，通過Image-Pro Plus6.0 測量腦梗死面積。梗死體積=梗死體積/對側(cè)大腦半球體積。

1.7炎癥因子測定 處死各組大鼠前，眼球取血，離心，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定各組血清TNF-α、Ang-1和VEGF水平，按照說明書操作。

1.8腦組織HE染色 分別于末次給藥24 h后，眼球取血處死動物，取腦組織，生理鹽水清洗，固定48 h后，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片，乙醇水化，蘇木素染色，1%鹽酸乙醇溶液分化，自來水沖洗返藍，浸入伊紅染液，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠進行封片，顯微鏡下觀察。

1.9RT-PCR檢測mRNA水平 取腦組織標本50 mg，Trizol法提取總RNA，取1 μl提取的RNA，采用微量分光光度計于A260和A280檢測提取的RNA純度，去除DNA后以GAPDH為內(nèi)參進行cDNA 合成，采用RT-PCR和相關(guān)軟件檢測TNF-α、Ang-1和VEGF的mRNA，40個循環(huán)，預變性95℃ 30 s，變性95℃ 10 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，延伸72℃ 5 min，測定mRNA的相對表達量。

1.10Western印跡檢測蛋白 取100 mg皮膚組織標本，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖3次，加入含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA低溫研磨，離心取上清，BCA法檢測蛋白濃度，562 nm測定OD值，計算蛋白濃度，將膠板安裝于電泳槽中，倒入電泳液，按40 μg蛋白上樣，電泳條件為電壓80 V、30 min，樣品進入分離膠后調(diào)節(jié)電壓至120 V，電泳結(jié)束后，取出玻璃板，切去濃縮膠及分離膠，進行轉(zhuǎn)膜，PVDF膜使用前浸于適量甲醇中活化，設置轉(zhuǎn)膜條件(80 V、120 min)，冰浴，取出PVDF膜，37℃恒溫搖床封閉2 h，將PVDF膜裁成長條，置于TNF-α、Ang-1、VEGF一抗(1∶100)和GAPDH(1∶500)，4℃恒溫搖床孵育過夜，1×TBST 洗PVDF膜3次，夾取PVDF膜置入二抗(辣根酶標記山羊抗兔IgG，1∶5 000)1 h，1×TBST 洗PVDF膜3次，DAB顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白表達條帶灰度，計算TNF-α、Ang-1和VEGF蛋白表達量。

1.11統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)、LSD法。

2 結(jié) 果

2.1各自神經(jīng)功能損傷評分和腦梗死體積比較 與對照組比較，其余5組神經(jīng)功能損傷評分和腦梗死體積顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，川芎龍蛭湯低、中、高劑量組及陽性組神經(jīng)功能損傷評分和腦梗死體積顯著降低(P<0.05)；與川芎龍蛭湯低劑量組比較，川芎龍蛭湯中、高劑量組和陽性組神經(jīng)功能損傷評分和腦梗死體積顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2各組血清TNF-α、Ang-1和VEGF水平比較 與對照組比較，其余5組血清TNF-α、Ang-1和VEGF水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，川芎龍蛭湯低、中、高劑量組和陽性組血清TNF-α顯著降低，而Ang-1和VEGF水平顯著升高(P<0.05)；與川芎龍蛭湯低劑量組比較，川芎龍蛭湯中、高劑量組TNF-α水平顯著降低，Ang-1、VEGF水平顯著升高(P<0.05)，而陽性組各指標無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能損傷評分和腦梗死體積及血清TNF-α、Ang-1、VEGF水平比較

2.3各組腦組織HE染色 對照組腦組織正常，腦細胞排列有序，細胞輪廓清晰、結(jié)構(gòu)完整，無水腫，形態(tài)正常，未見異常；與對照組比較，模型組細胞明顯減少，大量細胞壞死且排列紊亂，梗死灶內(nèi)細胞和血管壞死、腦組織細胞疏松、細胞形態(tài)改變、間質(zhì)水腫，川芎龍蛭湯低、中、高劑量組和陽性組腦組織損傷減輕，細胞稍顯疏松，水腫減輕。見圖1。

圖1 各組腦組織HE染色(×200)

2.4各組TNF-α、Ang-1和VEGF mRNA及蛋白水平比較 與對照組比較，其余5組腦組織中TNF-α、Ang-1、VEGF mRNA及蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，川芎龍蛭湯低、中、高劑量組和陽性組血清TNF-α mRNA及蛋白水平顯著降低，而Ang-1、VEGF mRNA及蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與川芎龍蛭湯低劑量組比較，川芎龍蛭湯中、高劑量組TNF-α mRNA及蛋白水平顯著降低，Ang-1、VEGF mRNA及蛋白水平顯著升高(P<0.05)，而陽性組各指標mRNA及蛋白水平無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組TNF-α、Ang-1和VEGF mRNA及蛋白水平比較

3 討 論

腦缺血損傷機制十分復雜，炎癥反應在腦缺血損傷中具有重要作用，缺血腦組織中炎癥因子的大量表達促進了炎癥反應，其中TNF-α是大腦缺血損傷中最重要炎癥細胞因子。TNF-α在腦組織中主要由星形細胞和小膠質(zhì)細胞分泌。金平等〔11〕發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α等免疫炎性因子與β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42表達水平明顯升高，免疫炎性反應或與慢性腦缺血所導致的腦組織Aβ1～42異常沉積有關(guān)。本研究給予不同劑量川芎龍蛭湯后可顯著降低血清TNF-α及腦組織中TNF-α mRNA和蛋白水平。這可能與川芎龍蛭湯方中枸杞多糖抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB和炎癥反應有關(guān)，對缺血再灌注小鼠腦損傷有明顯保護作用，石菖蒲、丹參、全蝎等通竅活血藥降低大鼠腦缺血再灌注損傷時炎癥細胞因子的水平，從而減輕腦缺血再灌注損傷程度〔12〕。

腦缺血損傷直接引發(fā)局部腦組織缺血和缺氧，新生血管能明顯增加缺血周邊的腦血流量，微血管新生是重建缺血缺氧區(qū)域血供的主要途徑，血管新生程度直接關(guān)系到缺血組織預后。血管生成素是由血管內(nèi)皮周圍組織分泌的細胞生長因子，有很強的促血管生成作用，Ang-1在介導內(nèi)皮細胞與周圍基質(zhì)和間質(zhì)之間起著至關(guān)重要的作用，Ang-1低表達使新生血管不穩(wěn)定且易發(fā)生滲漏，高表達可促進內(nèi)皮細胞和鄰近的周細胞、成纖維細胞增多，毛細血管緊密，保護新生血管〔13〕。張涓等〔14〕發(fā)現(xiàn)，Ang-1/內(nèi)皮細胞TEK酪氨酸激酶(Tie)2信號通路參與血管生成的最后階段，促進損傷神經(jīng)功能恢復，在血管新生、神經(jīng)再生中發(fā)揮重要作用。本研究給予不同劑量川芎龍蛭湯后可顯著升高血清Ang-1和腦組織中Ang-1 mRNA及蛋白水平，這與川芎龍蛭湯方中川芎、地龍、水蛭等活血化瘀類中藥通過血管生成素和整合素通路干預促進血管生成、提高腦血流量、增強相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄、上調(diào)某些神經(jīng)營養(yǎng)因子表達、使腦缺血部位的血管新生等有關(guān)〔15〕。

VEGF是血管生成的關(guān)鍵性因子，在腦缺血缺氧的誘導下迅速增多，啟動血管生成，促進神經(jīng)功能恢復，參與腦缺血損傷病理過程中參與神經(jīng)和血管的重塑〔16〕。VEGF可促進血管新生，保護神經(jīng)元免受缺血缺氧導致的損傷，參與并調(diào)控腦缺血后血管新生，腦缺血可誘導VEGF表達上調(diào)。腦缺血發(fā)作患者血清缺氧誘導因子(HIF)-1α、VEGF水平升高，腺苷預處理應用于局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠，增加VEGF、HIF-1α表達以保護腦組織，從而保護缺血神經(jīng)元〔17〕。本研究給予不同劑量川芎龍蛭湯后可顯著升高血清VEGF及腦組織中VEGF mRNA和蛋白水平，這與川芎龍蛭湯方中川芎、生黃芪等激活HIF-1α/VEGF信號轉(zhuǎn)導通路，升高缺血再灌注大鼠血清膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、VEGF水平及缺血腦組織Notch1 mRNA表達、促進腦缺血損傷大鼠腦內(nèi)血管新生等有關(guān)〔18〕。

綜上，實驗性腦缺血損傷模型大鼠TNF-α、Ang-1和VEGF水平顯著升高，給予川芎龍蛭湯可顯著改善腦組織損傷，其機制與降低TNF-α、升高Ang-1和VEGF水平有關(guān)。