miR-146a-5p對炎癥反應因子及脂代謝因子的調節作用

孫雅楠 李斯 尹明潔 (唐山市工人醫院 內分泌二科，河北 唐山 063000；心內四科)

2型糖尿病(T2DM)目前被認為是一種慢性低度炎癥反應，主要由于營養物質堆積所觸發的肝臟、胰腺等組織細胞的炎癥反應〔1,2〕，能夠導致葡萄糖及脂質代謝紊亂并降低機體對胰島素的敏感性。研究顯示T2DM患者機體脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6等炎癥因子水平較健康人群顯著升高〔3～5〕。miR-146a-5p基因位于人第5號染色體，是第一個被發現具有免疫調節功能的miRNA，研究顯示在T2DM患者外周血單個核細胞中miR-146a-5p表達水平顯著降低，并且miR-146a-5p能夠通過炎癥誘導調節胰島細胞凋亡〔6,7〕，在牙齦卟啉單胞菌(P.g)LPS誘導的HepG2細胞炎性反應時，miR-146a-5p表達量增加是否對細胞中白細胞介素受體相關激酶(IRAK)-1、膽固醇代謝相關因子ATP結合盒轉運蛋白(ABC)G1蛋白表達水平產生影響，尚未見文獻報道。本研究以HepG2細胞為研究模型，分別以P.gLPS刺激、miR-146a-5p-mimics轉染為干預手段，探討在細胞炎癥反應狀態下miR-146a-5p對炎癥反應及脂質代謝因子的調節作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料 HepG2細胞系由中國協和醫科大學基礎研究所細胞中心提供。

1.2實驗分組 實驗分為4組：HepG2細胞體外P.gLPS刺激為P.gLPS刺激組；HepG2細胞體外轉染miR-146a-5p-mimics為miR-146a-5p轉染組；He-pG2細胞體外轉染miR-146a-5p-mimics后經P.gLPS刺激為miR-146a-5p轉染+P.gLPS刺激組；陰性對照組未經P.gLPS刺激未轉染miR-146a-5p-mimics，其他培養條件與各組相同。

1.3細胞培養 將復蘇后的HepG2細胞加入適量含有10%胎牛血清的DMEM培養液稀釋成105/ml濃度移至培養瓶中，置于37%CO2培養箱內培養，次日更換培養液，倒置顯微鏡下觀察細胞形態，待細胞生長鋪滿瓶壁即可傳代。

1.4細胞刺激與轉染 P.gLPS刺激：P.gLPS刺激組與miR-146a-5p轉染+P.gLPS刺激組分別加入P.gLPS的濃度為1 μg/ml，培養6 h收獲細胞，用于后續實驗。miR-146a-5p-mimics轉染：將配制好的miR-146a-5p-mimics轉染復合物250 μl，加入培養好的HepG2孔板中，再吸取Opti-MEM培養基750 μl/孔，加入各孔中，前后輕柔搖動細胞板至混合均勻。將細胞培養板置于 37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養24 h。轉染6 h后吸取1 ml普通DMEM培養基(含有20%胎牛血清、無抗生素)，加入各孔。

1.5Western印跡 細胞轉染完成后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后應用放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解獲得細胞總蛋白，應用考馬斯亮藍法測蛋白濃度，之后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳過后取目的蛋白條帶恒流200 mA，轉膜1 h。轉膜完成后，將膜用TBST水洗，放入封閉液中，在搖床上封閉1 h。按1∶100或1∶200的比例配制一抗體與一抗稀釋液，將封閉好的膜放入配好的一抗稀釋液，4℃搖床過夜。按1∶1 000或1∶2 000的比例配制二抗與二抗稀釋液，將膜放入配好的二抗稀釋液，常溫搖床上搖3 h。二抗孵育完成后，TBST洗3次，加顯色液在凝膠成像系統顯色，并記錄實驗結果。

1.6考馬斯亮藍法測蛋白濃度 應用分光光度計測定并計算每管蛋白的吸光度，制作出標準曲線。吸取3 μl待測蛋白液，加入100 μl考馬斯亮藍顯色液，用分光光度計測定并計算出吸光度值，計算出待測蛋白的濃度。

1.7轉膜及染色 電泳分離蛋白分子，轉膜，將膜放入封閉液中，在搖床上封閉1 h。加一抗，4℃搖床過夜。加二抗，常溫搖床上搖3 h。二抗孵育完成后，TBST洗3次，加顯色液在凝膠成像系統顯色，并記錄實驗結果。

1.8統計學分析 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗、方差分析。GraphPAD Prism5.0軟件對實驗數據作圖。

2 結 果

P.g LPS刺激組IRAK-1蛋白水平(1.16±0.12)顯著高于陰性對照組(0.73±0.89，P<0.05)。miR-146a-5p轉染組IRAK-1蛋白水平(0.52±0.32)顯著低于陰性對照組(P<0.05)。miR-146a-5p轉染組ABCG1蛋白水平(0.47±0.05)與陰性對照組相比未見明顯變化(P>0.05)。miR-146a-5p轉染+P.gLPS刺激組IRAK-1蛋白水平(0.66±0.04)顯著低于P.gLPS刺激組(P<0.01)。P.gLPS刺激組ABCG1蛋白水平(0.67±0.03)顯著高于陰性對照組(0.51±0.12，P<0.05)。miR-146a-5p轉染+P.gLPS刺激組ABCG1蛋白水平(0.43±0.02)顯著低于P.g LPS刺激組(P<0.01)。見圖1。

1～4：陰性對照組、miR-146a-5p轉染組、P.g LPS刺激組、miR-146a-5p轉染+P.gLPS刺激組圖1 miR-146a-5p拮抗P.gLPS誘導的HepG2細胞IRAK-1、ABCG1上調

3 討 論

T2DM作為一種機體慢性炎癥反應，以胰島素抵抗、血糖水平升高、脂代謝紊亂為主要特征，目前研究顯示T2DM患者機體炎性因子如：LPS、腫瘤壞死因子-α水平顯著升高，并且升高的炎性因子及其下游級聯的炎性反應將會降低機體胰島素敏感性〔8，9〕。當敲除大鼠炎癥因子Toll樣受體(TLR)-4基因后，能夠增加大鼠肝臟胰島素敏感性，降低炎性反應，改善肝臟脂肪變性〔10〕。說明降低機體慢性炎癥反應將有利于恢復機體對胰島素的敏感性及有利于機體脂質代謝。

miR-146a-5p作為具有免疫調節功能的miRNA，研究顯示其具有促進炎癥修復，抑制慢性炎癥反應的作用〔11，12〕。研究證實miR-146a-5p在T2DM患者外周血單個核細胞中及T2DM大血管并發癥患者血漿中表達均顯著降低〔6，7〕。并且在T2DM合并腦卒中患者中檢測到血小板和血漿miR-146a-5p水平明顯下調，這種下調可能級聯誘導血小板激活，在中國T2DM患者中miR-146a-5p表達水平降低是缺血性腦卒中的危險因素〔13〕。本研究結果說明在細胞炎性反應時miR-146a-5p通過下調IRAK-1發揮抑制炎癥、防止炎癥反應放大的作用。miR-146a-5p具有調節炎癥反應的功能，抑制IRAK-1表達是其發揮抑制炎癥反應的作用途徑之一。如：應用LPS誘導肺泡巨噬細胞產生炎癥反應，檢測到炎性細胞因子白細胞介素-6、白細胞介素-1β等炎癥因子表達水平均升高，予以miR-146a-5p干預后其通過顯著下調IRAK-1發揮抑制炎性因子表達的作用〔14〕，還有研究發現炎癥因子刺激可誘導MIN6細胞和人類胰島細胞miR-146a表達水平升高，miR-146a進一步通過下調IRAK-1發揮抑制炎癥作用〔15〕，本研究結果證實miR-146a-5p在調整細胞炎癥反應等病理生理過程中發揮重要作用。

ABCG1在膽固醇逆轉運的初始階段發揮促進細胞內游離膽固醇外流的作用，起到清除組織細胞內多余膽固醇的作用〔16，17〕。LPS可以誘導腹膜巨噬細胞產生炎癥反應，并抑制目標基因ABCG1的表達〔18，19〕。LPS炎性刺激小鼠BV-2小膠質細胞，顯著下調ABCG1 轉錄水平和蛋白水平的表達〔20〕。本研究結果說明在細胞炎性反應時miR-146a-5p能夠顯著下調HepG2細胞ABCG1蛋白水平。研究顯示，許多miRNA可以通過上調或下調ABCG1表達水平參與機體膽固醇代謝〔21〕，本研究顯示miR-146a-5p能夠負向調節致炎因子P.gLPS介導的膽固醇代謝過程。

綜上，miR-146a-5p具有抑制炎癥因子及調節脂質代謝的功能，為進一步研究慢性炎癥所引起的病理及生理變化奠定基礎。