沉默lnc-SLC2A12-10∶1抑制人胃癌細胞系AGS增殖、遷移和侵襲

劉 磊，李世寶，張好良*

(1.徐州醫科大學 生理學教研室，江蘇 徐州 221004； 2.徐州醫科大學附屬醫院 檢驗科，江蘇 徐州 221002)

胃癌(gastric cancer)在中國惡性腫瘤中的發病率和病死率均居前列[1]，早期胃癌治療后5年生存率可超過90%，甚至治愈[2]，但中國早期胃癌的診治率低于10%。傳統的腫瘤標志物CEA、CA19-9、CA72-4敏感性和特異性均不高，因此，尋找其他非侵入性的生物標志物篩選胃癌是非常必要的。外泌體中包含大量的蛋白質和不同的RNA，它們可以調節受體細胞的行為，并作為疾病的循環生物標志物[3]。既往研究表明腫瘤源性外泌體中長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)含量較高[4]，不同lncRNA在腫瘤的進展中可發揮促癌或抑癌的作用[5-8]。

Lnc-SLC2A12-10∶1在基因芯片、胃癌細胞和胃癌患者血清中外泌體中均高表達，提示lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌進展中發揮促癌基因的作用[9]。為進一步研究lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌中的調控機制，本實驗采取lnc-SLC2A12-10∶1基因干擾技術構建lnc-SLC2A12-10∶1沉默的胃癌AGS細胞，探討lnc-SLC2A12-10∶1對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞系AGS和人胚胎腎上皮細胞系HEK-293T(中國科學院細胞庫)；DMEM培養基(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；CCK-8試劑盒和Polybrene(徐州維科曼得生物工程有限公司)；Transwell小室和Matrigel基質膠(Corning公司)；pLVX-shRNA2-Puro vector(湖南科愛醫療器械有限公司)；miRNA 引物第一鏈 cDNA 合成試劑盒和引物(上海生工生物工程技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 短發夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)的設計及制備：針對lnc-SLC2A12-10∶1的靶點，構建shRNA片段序列(表1，shRNA由上海生工生物工程技術有限公司合成)。Oligo片段兩兩配對，混勻后置于PCR儀中95 ℃, 5 min，室溫靜置20 min，形成雙鏈Oligo片段，經酶切后連接于載體上構建pLVX-shRNA-Puro。

1.2.2 慢病毒包裝：將HEK-293T細胞按2.5×106個/mL的濃度接種于10 cm培養皿中，過夜培養。細胞匯合度在70%～80%開始按操作手冊包裝病毒。6 h后，更換新鮮DMEM完全培養基。24 h后在熒光顯微鏡下觀察報告基因(ZsGreen1)表達情況，判斷感染效率。在48、72和96 h連續3次收集病毒原液。將收集的原液 2 000×g離心5 min，去除細胞碎片，上清經過0.45 μm濾膜過濾。

1.2.3 穩定轉染多克隆AGS細胞的篩選：將胃癌AGS細胞按照1×105個/孔接種在6孔板中，第2天細胞匯合度在50%～70%可進行慢病毒感染。每孔加入50 μL慢病毒和1 μL Polybrene混勻，8 h后換成完全培養基。24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察ZsGreen1的表達情況，判斷感染效率。感染48 h后換成含0.5 μg/mL嘌呤霉素篩選培養基，繼續培養，每日觀察，根據細胞狀態傳代，待細胞感染率達 80% 時結束篩選。按照文獻[9]進行RT-qPCR并觀察干擾效率。

1.2.4 CCK-8法檢測胃癌細胞增殖：96孔板每孔加100 μL細胞懸液，調整細胞濃度至3×104個/mL，置于培養箱培養，每組細胞設置5個復孔。分別在22、46 h更換培養基為CCK-8懸液(100 μL完全培養基+10 μL CCK-8液/孔)，置于培養箱作用2 h后，在酶標儀450 nm處檢測各孔吸光度(A)值。

1.2.5 劃痕實驗檢測胃癌細胞遷移：將細胞按1×106個/mL鋪于6孔板中，待細胞貼壁并增殖滿后，棄去培養基，用10 μL槍頭進行劃痕， PBS清洗3次， 去除劃下的細胞，加入1% FBS血清濃度的DMEM培養基，繼續培養。 0、24 和48 h分別于相同位置拍照并分析。

表1 Lnc-SLC2A12-10∶1 shRNA片段序列Table 1 Sequences of lnc-SLC2A12-10∶1 shRNA fragment

1.2.6 Transwell小室法檢測胃癌細胞遷移：在24孔板中加入完全培養基，放入Transwell小室，小室內加入200 μL細胞懸液，調整細胞為2×105個/mL，培養48 h。取出Transwell小室，棄去孔中培養基，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3次，將小室翻轉晾干；0.1%結晶紫染液染色20 min，用PBS清洗3次，用棉簽輕輕擦掉上室殘留細胞。倒置顯微鏡觀察拍照，200倍鏡下取孔的上、下、左、右、中5個視野計數細胞，并計算平均值。

1.2.7 Transwell小室法檢測胃癌細胞侵襲：提前將Matrigel基質膠放在4 ℃過夜融化。將Transwell放入24孔板，將Matrigel基質膠與預冷的DMEM培養基按1∶5體積稀釋，取100 μL稀釋膠加入Transwell上室，然后于培養箱中靜置3 h，使Matrigel膠凝固。向Transwell上室加入細胞懸液100 μL，下室加入800 μL完全培養基培養48 h。取出Transwell小室，棄去孔中培養基，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3次，將小室翻轉晾干；0.1%結晶紫染液染色20 min，用PBS清洗3次，用棉簽輕輕擦掉上室殘留細胞。倒置顯微鏡觀察拍照，200倍鏡下取孔的上、下、左、右、中5個視野計數細胞，并計算平均值。

1.2.8 Lnc-SLC2A12-10∶1靶向微小RNA(micro RNA,miRNA)軟件預測和熒光定量 PCR 驗證:根據lnc-SLC2A12-10∶1序列，用生物信息預測軟件(上海伯豪生物科技公司)預測可能的靶向miRNA。使用miRNA 第一鏈 cDNA 合成試劑盒，按試劑說明書操作，獲得miRNA cDNA。再用表2引物序列進行RT-qPCR 驗證，以U6為內參，鐵蛋白重鏈1(ferritin heavy chain 1，FTH1)為lnc-SLC2A12-10∶1親本基因，結果基于2-△△Ct法計算，所有實驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Lnc-SLC2A12-10∶1干擾的胃癌AGS細胞株的建立和鑒定

轉染48 h后觀察綠色熒光ZsGreen1的表達情況，各組轉染效率均在80%以上(圖1)。shRNA1、shRNA2、shRNA3(short hairpin RNA)均能有效干擾lnc-SLC2A12-10∶1的表達，shRNA2敲減效果最為明顯，因此選擇shRNA2組進行下一步實驗。

表2 預測miRNA和lnc-SLC2A12-10∶1親本基因引物

2.2 敲低lnc-SLC2A12-10∶1對AGS細胞增殖的影響

48 和72 h時lnc-SLC2A12-10∶1 shRNA2組較AGS NC組A值明顯降低(圖2)(P<0.05)。

2.3 沉默lnc-SLC2A12-10∶1對AGS細胞遷移的影響

與對照組細胞比較，沉默lnc-SLC2A12-10∶1后，細胞劃痕愈合減慢(圖3)(P<0.05)，遷移到Transwell下室的細胞量明顯減少(圖4)(P<0.05)。

2.4 沉默lnc-SLC2A12-10∶1對AGS細胞侵襲的影響

與對照組相比，沉默lnc-SLC2A12-10∶1后AGS細胞的侵襲能力明顯減低(圖5)(P<0.05)。

2.5 Lnc-SLC2A12-10∶1靶向miRNA熒光定量 PCR 驗證

根據軟件預測，lnc-SLC2A12-10∶1可能的靶向miRNA是hsa-miR-105-5p、hsa-miR-150-3p、hsa-miR-449b-3p、hsa-miR-588、hsa-miR-1275和hsa-miR-4701-5p。沉默lnc-SLC2A12-10∶1后，lnc-SLC2A12-10∶1的親本基因FTH1表達增加(P<0.05)，同時hsa-miR-105-5p和hsa-miR-150-3p的表達也明顯增多(P<0.05)(圖6)。

*P<0.05 compared with NC group, scale bar=100 μm圖1 不同lnc-SLC2A12-10∶1 shRNA轉染AGS細胞后的熒光效果及干擾效率

*P<0.05 compared with NC group圖2 CCK-8法檢測沉默lnc-SLC2A12-10∶1對AGS細胞增殖的影響Fig 2 Effect of lnc-SLC2A12-10∶1 silencing on proliferation of AGS cells detected by CCK-8

3 討論

胃癌的形成涉及到原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及表觀遺傳學調控等。近年來，大量研究證實lncRNA在胃癌的發生發展以及介導治療耐藥性等方面中起到重要的作用。Lnc-CTSLP4可抑制胃癌細胞的遷移、侵襲和上皮間質化[10]；沉默lncRNA TRPM2-AS可抑制胃癌細胞的增殖、 轉移和放射抵抗[11]等。因此，尋找診斷lncRNA標志物及研究其調控機制，為胃癌診斷和治療提供新的靶點，將具有巨大的臨床應用前景和社會效益。

*P<0.05 compared with NC group, scale bar=200 μm圖3 劃痕實驗檢測沉默lnc-SLC2A12-10∶1對AGS細胞遷移的影響Fig 3 Effect of lnc-SLC2A12-10∶1 silencing on AGS cell migration detected by wound healing

*P<0.05 compared with NC group, scale bar=200 μm圖4 Transwell小室法檢測沉默lnc-SLC2A12-10∶1對AGS細胞遷移的影響Fig 4 Effect of lnc-SLC2A12-10∶1 silencing on AGS cell migration detected by Transwell assay n=3)

*P<0.05 compared with NC group, scale bar=200 μm圖5 Transwe小室法檢測沉默lnc-SLC2A12-10∶1對AGS細胞侵襲的影響Fig 5 Effect of lnc-SLC2A12-10∶1 silencing on AGS cell invasion detected by Transwell assay n=3)

*P<0.05 compared with NC group圖6 沉默lnc-SLC2A12-10∶1對預測miRNA和親本基因的影響Fig 6 Effect of lnc-SLC2A12-10∶1 silencing on predicted miRNA and parental gene

Lnc-SLC2A12-10∶1是新發現的lncRNA，位于6號染色體，含有1個外顯子，是lncRNA，全長701 bp。前期研究發現lnc-SLC2A12-10∶1高表達與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移、分化程度有關[9]，但lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌中的功能未見報道。本課題組通過設計lnc-SLC2A12-10∶1干擾序列構建沉默細胞株，進行細胞功能實驗，結果顯示，敲減lnc-SLC2A12-10∶1之后，AGS細胞增殖、侵襲和遷移能力都受到抑制，表明lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌細胞中發揮促癌的作用。

LncRNA發揮功能，通常是通過序列特異性和構象結合與DNA、RNA和蛋白質相互作用，發揮支架、誘餌(分子壑或miR吸附)和RNA增強作用[12-13]。檢索ensembl數據庫發現，lnc-SLC2A12-10∶1屬于假基因(pseudogene)鐵蛋白重鏈1假基因26(ferritin heavy chain 1 pseudogene 26，FTH1P26)。假基因轉錄本最近被證明可以發揮競爭內源性RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)作用吸附miRNA，從而調控親本基因的表達[14]。通過生物信息預測軟件預測，發現lnc-SLC2A12-10∶1可能的靶向miRNA是hsa-miR-105-5p、hsa-miR-150-3p、hsa-miR-449b-3p、hsa-miR-588、hsa-miR-1275和hsa-miR-4701-5p。沉默lnc-SLC2A12- 10∶1后，lnc-SLC2A12-10∶1的親本基因FTH1表達恢復，同時hsa-miR-105-5p和hsa-miR-150-3p表達也明顯增加，提示hsa-miR-105-5p和hsa-miR-150-3p可能是lnc-SLC2A12-10∶1的靶向miRNA，并參與lnc-SLC2A12-10∶1對親本基因FTH1的調控。

綜上，本研究成功構建了lnc-SLC2A12-10∶1沉默的胃癌細胞株。實驗初步證實lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌細胞中發揮促癌作用，若在腫瘤微環境中進行靶向敲除，理論上將會提高胃癌治療效果。鑒于lnc-SLC2A12-10∶1在胃癌細胞惡性生物學行為中的重要作用，其具體作用和機制仍需進一步研究。