IL-6抑制劑對種植體周圍炎小鼠模型的療效及其作用機制探討

門貝 朱燕

[摘要]目的：探討IL-6抑制劑對種植體周圍炎小鼠模型的療效及其作用機制。方法：選取4周齡雄性小鼠（C57BL/6J）15只，實驗總共分為三組（每組5只）：對照組（植入種植體，但未進行結扎誘導）、模型組（結扎誘導，構建種植體周圍炎小鼠模型）和抑制劑組（結扎誘導+腹腔注射IL-6抑制劑）。使用微計算機斷層掃描（Micro-CT）檢測種植體周圍骨丟失，蘇木精和伊紅（HE）染色檢測種植體周圍牙齦組織的炎癥浸潤，使用RT-qPCR檢測牙齦組織中白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α） mRNA相對表達量，使用Western blot法檢測牙齦組織中NF-κB通路相關蛋白p-P65和p-IκBα蛋白表達水平。結果：Micro-CT結果顯示IL-6抑制劑可減少種植體周圍炎的骨喪失。HE結果顯示IL-6抑制劑處理后，小鼠炎癥浸潤顯著減少。RT-qPCR和Western blot結果顯示，IL-6抑制劑可顯著降低牙齦組織中IL-6、TNF-α mRNA相對表達量以及p-P65和p-IκBα的蛋白表達水平。結論：IL-6抑制劑可抑制種植體周圍炎的骨喪失和炎癥浸潤，這些治療效果可能與抑制TNF-α的表達和NF-κB信號通路有關。

[關鍵詞]IL-6抑制劑;種植體周圍炎;小鼠模型;TNF-α;NF-κB通路;骨流失

[中圖分類號]R782.12? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）05-0090-04

Curative Effect and Mechanism of IL-6 Inhibitor on Mice with Peri-implantitis

MEN Bei1，ZHU Yan2

（1.Department of Prosthodontics and Implant，Dazhong Stomatological Hospital，Wuhan 430000，Hubei，China;2.Department of Prosthodontics and Implant，Hubei Provincial People's Hospital，Wuhan 430060，Hubei，China）

Abstract： Objective? To investigate the curative effect and mechanism of IL-6 inhibitor on mice with peri-implantitis. Methods? Fifteen 4-week-old male mice （C57BL/6J） were selected， and the experiment was divided into 3 groups （5 mice in each group： the control group （implants implanted， but no ligation induction）， the model group （ligation induction： construction peri-implantitis mouse model） and the inhibitor group （ligation induction + intraperitoneal injection of IL-6 inhibitor）. Microcomputed tomography （Micro-CT） was used to detect peri-implant bone loss. Hematoxylin and eosin （HE） staining was used to detect inflammatory infiltration in peri-implant gingival tissue. The mRNA relative expression levels of interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in gingival tissue were detected by RT-qPCR. The protein expression levels of NF-κB pathway related proteins p-P65 and p-IκBα in gingival tissue were detected by Western blot. Results? Micro-CT results showed that IL-6 inhibitor could reduce bone loss in peri-implant inflammation. HE results showed that inflammatory infiltration in mice was significantly reduced after IL-6 inhibitor treatment. RT-qPCR and Western blot results showed that IL-6 inhibitor significantly decreased the mRNA relative expression levels of IL-6 and TNF-α， and the protein expression levels of p-P65 and p-IκBα in gingival tissue. Conclusion? IL-6 inhibitors can inhibit bone loss and inflammatory infiltration in peri-implantitis， and these therapeutic effects may be related to the inhibition of TNF-α expression and NF-κB signaling pathway.

Key words： IL-6 inhibitor; peri-implantitis; mice model; TNF-α; NF-κB pathway; bone loss

近年來，種植義齒由于其高度可預測性和高成功率被廣泛應用于無牙牙合或牙列缺損患者的恢復[1]，然而據報道，仍然有30%的患者由于牙科植入物引起種植體周圍炎（Peri-implantitis）[2]，種植體周圍炎是種植體周圍組織發生炎癥，可導致骨喪失[3-5]，因此了解種植體周圍炎的發病機制至關重要。研究發現IL-6在種植體周圍炎中扮演著重要的作用，研究報道IL-6在種植體周圍炎患者中高表達[6]，且抑制IL-6的表達可顯著抑制種植體周圍炎的發展[7]。然而IL-6在種植體周圍炎中的作用機制還不完全明確，本研究將通過構建種植體周圍炎小鼠模型，探討IL-6抑制劑對種植體周圍炎小鼠模型的療效，并深入探究其作用機制，爭取為臨床上治療種植體周圍炎提供新的理論參考依據。

1? 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：IL-6抑制劑（北京百奧萊博科技有限公司，貨號為：M07110）;鈦種植體（四川大學國家生物材料工程研究中心，中國成都）;甲醛（Thermo Fisher）;蘇木精染色液（上海紫一試劑廠）;伊紅染色液（上海古朵生物科技有限公司）;反轉錄試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）;RT-qPCR試劑盒[西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司];IL-6、TNF-α和β-actin引物（上海吉瑪制藥有限公司）;p-P65（Abcam）;p-IκBα（上海鈺博生物科技有限公司）;β-actin（Abcam）;二抗（北京博爾西科技有限公司）;顯微計算機斷層掃描儀（Skyscan， Kontich， Belgium）;顯微鏡（MV2100，蘇州卡吉德化學科技有限公司）。

1.2 實驗動物：4周齡雄性小鼠（C57BL/6J）15只，體重為18～22 g，購自華中科技大學動物實驗中心，生產許可證號為：SCXK（鄂）2021—0009。實驗前馴化1周。在實驗期間，小鼠隨機喂食軟性飼料。

1.3 種植體周圍炎的誘導：所有小鼠吸入3%的異氟醚進行麻醉，然后拔除左側上頜第一、二、三臼齒，拔牙部位愈合8周后，將表面光滑的螺旋形狀鈦種植體植入上頜左第二磨牙區域，每只小鼠1顆，然后去除牙齦瓣并鉆孔截骨，種植體植入牙槽骨深度約1 mm。種植體愈合4周后，在種植體根尖處和頭部，分別用絲線扎入種植體，誘導種植體周圍炎。正常對照組種植體未進行結扎。

1.4 給藥和實驗分組：15只小鼠，實驗總共分為3組（每組5只）：對照組（植入種植體，但未進行結扎誘導）、模型組（結扎誘導）和抑制劑組（結扎誘導+腹腔注射IL-6抑制劑）。種植體周圍炎小鼠模型構建成功后，腹腔注射5 mg/kg的IL-6抑制劑，每4周注射1次，總共注射3次，最后一次給藥2 d后處死小鼠并檢測相應指標，其中對照組和模型組給予相同劑量的生理鹽水。

1.5 Micro-CT實驗：將小鼠處死后，取各組小鼠上頜骨，切除皮膚以及肌肉后，在顯微鏡下收集腭側牙齦組織，用4%的多聚甲醛進行固定，使種植體的頭部和軸在矢狀面和冠狀面彼此垂直，然后在各向同性體素分辨率下進行檢測。之后導入Dolphin軟件，生成圖像。然后采用三維形態分析并計算種植體周圍骨丟失量[8]。

1.6 蘇木精和伊紅（HE）染色實驗：取牙齦組織使用4%多聚甲醛進行固定，放入包埋盒中，用流水沖洗固定液，然后使用不同濃度的酒精進行脫水，用二甲苯進行透明，并將已透明的組織放入石蠟中進行包埋，之后對包埋好的組織進行切片（5 μm）。然后進行染色，將切片用蘇木精水溶液進行染色，蒸餾水沖洗后使用酒精進行脫水，在用伊紅染色液進行染色3 min，脫水封片后在顯微鏡下進行觀察。

1.7 反轉錄酶-聚合酶鏈反應（RT-qPCR）實驗：分離各組牙齦組織，加入裂解液進行勻漿，并使用試劑盒提取總RNA，檢測提取的RNA濃度和質量后，使用反轉錄試劑盒把RNA反轉錄為cDNA，然后以β-actin作為內參進行反轉錄酶-聚合酶鏈反應。IL-6引物序列為：F：5’-GCTGGAGTCACAGAAGGAGTGGC-3’;R：5’-GGCATAAC GCACTAGGTTTGCCG-3’。TNF-α引物序列為：F：5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGG-3’;R：5’-TATCTCTCAGCTCCACGCCATT-3’。β-actin引物序列為：F：5’-GAGCGCGGCTACAGCTT-3’;R：5’-TCCTTAATGTCACGCACGCACGATTT-3’。

1.8 蛋白免疫印跡（Western blot）實驗：收集各組小鼠牙齦組織，提取總蛋白，并使用BCA法測定蛋白濃度，將變性后的蛋白溶液進行上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后進行轉膜，轉膜后使用脫脂牛奶（5%）室溫封閉1 h后，分別加入p-P65（1：500）、p-IκBα（1：400）和β-actin（1：5 000）一抗，然后4℃條件下培養過夜，加入二抗（辣根過氧化物酶標記）（1：5 000），室溫條件下培養1 h后ECL進行顯影，并進行分析和檢測灰度值。

1.9 統計學分析：使用SPSS 26.0對所用數據進行分析處理，并用Graphpad prism 8.0作圖，兩組間比較使用t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2? 結果

2.1 三組種植體周圍骨質流失情況：各組種植體存活率均為100%，由圖1A可知，與對照組相比，模型組的骨尖水平較高，而與模型組相比，抑制劑組的骨尖水平較低。由圖1B可知，與對照組相比，模型組的種植體周圍的骨質流失體積顯著增多，差異有統計學意義（P<0.05）;而與模型組相比，抑制劑組的骨質流失體積顯著減少，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 三組牙齦組織炎癥浸潤情況：由圖2可知，對照組有輕度浸潤，與對照組比較，模型組牙齦炎癥嚴重浸潤;而與模型組相比，抑制劑組牙齦浸潤程度明顯減輕。

2.3 三組牙齦組織中IL-6 mRNA表達：由圖3可知，與對照組相比，模型組的IL-6 mRNA顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組相比，抑制劑組的IL-6 mRNA相對表達量顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.4 三組牙齦組織中TNF-αmRNA的表達：由圖4可知，與對照組相比，模型組的TNF-αmRNA相對表達量顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組相比，抑制劑組的TNF-αmRNA相對表達量顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。表明IL-6抑制劑可顯著抑制種植體周圍炎小鼠牙齦組織中TNF-α的表達。

2.5 三組牙齦組織中NF-κB通路相關蛋白表達：由圖5可知，與對照組相比，模型組的p-P65和p-IκBα蛋白表達水平均顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05）;而與模型組相比，抑制劑組的p-P65和p-IκBα蛋白表達水平均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。表明IL-6抑制劑可能通過抑制NF-κB通路抑制促炎因子的釋放。

3? 討論

近年來，隨著人們生活水平的提高，越來越多的人選擇種植義齒來修復失牙，然而隨著種植體在人群中應用的增加，種植體所引起的相關疾病也在逐漸增加，包括種植體周圍黏膜炎和種植體周圍炎[9]。據研究報道，有將近45%的種植體部位和近55%的種植體患者表現為種植體周圍炎，種植體周圍炎的主要表現為種植體周圍組織損傷，具體為種植體周圍牙槽骨破壞以及炎癥反應[10-11]。種植體周圍炎的發展是由多種因素造成的，其中白介素和腫瘤壞死因子等細胞因子在種植體周圍炎的發生和發展中起著重要作用，白介素-6（IL-6）是一種炎癥因子[12]，多個研究已經報道IL-6可促進種植體周圍炎的進展[6，13]。IL-6抑制劑的使用已被證實在多種疾病中具有顯著抗炎作用[14-15]。余科等研究發現IL-6抑制劑可顯著減輕兔體內種植體炎癥性骨吸收，并增加周圍骨體積率[16]。然而IL-6抑制劑在種植體周圍炎中的作用機制還不清楚，本研究通過構建種植體周圍炎小鼠模型發現IL-6抑制劑可顯著抑制種植體周圍炎導致的周圍組織骨流失并抑制牙齦組織中IL-6的表達，且HE染色結果發現，IL-6抑制劑處理后可顯著抑制種植體周圍組織的炎性浸潤，這與余科等的研究結果一致。

腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種細胞因子，主要由活化的單核-巨噬細胞分泌，參與調控機體的炎癥反應。近年來，有學者認為TNF-α在種植體周圍炎中也具有重要的作用[17]。本研究發現IL-6抑制劑處理種植體周圍炎模型小鼠后，可顯著抑制牙齦組織中TNF-αmRNA的表達，這表明IL-6抑制劑可通過抑制種植體周圍組織骨流失以及抑制TNF-α的表達減輕種植體周圍炎。

NF-κB通路是一種經典的炎癥反應相關的重要信號通路，在NF-κB通路被激活時，P65和IκBα發生磷酸化，NF-κB信號通路參與調控各個階段的炎癥反應，并被證實可調控包括TNF-α在內的許多炎癥細胞因子。前人已經證實NF-κB通路在牙周炎的發生和發展中起著重要的調控作用[18-19]。本研究中發現，IL-6抑制劑可顯著抑制種植體周圍炎小鼠牙齦組織中p-P65和p-IκBα蛋白表達水平，這表明，IL-6抑制劑可抑制NF-κB信號通路P65和IκBα蛋白的磷酸化水平。

綜上，IL-6抑制劑可通過抑制牙齦組織骨流失以及抑制促炎因子TNF-α的釋放減輕小鼠種植體周圍炎，其機制可能與抑制NF-κB信號通路有關。

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[收稿日期]2021-08-17

本文引用格式：門貝，朱燕.IL-6抑制劑對種植體周圍炎小鼠模型的療效及其作用機制探討[J].中國美容醫學，2022，31（5）：90-93.