基于TGF-β1/Smad通路探討A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕的抑制作用及機(jī)制

張雪 蘭東 寧淑華 于思思

[摘要]目的：探討A型肉毒毒素（BTXA）通過(guò)TGF-β1/Smad通路對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞抑制作用及其機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，采用0.2、0.4、0.8 U/ml的BTXA處理成纖維細(xì)胞，分別作為0.2 U/ml BTXA組、0.4 U/ml BTXA組、0.8 U/ml BTXA組，空白對(duì)照組不采用BTXA（0 U/ml）處理，0.8 U/ml BTXA+TGF-β1組用0.8 U/ml BTXA和10 ng/ml的TGF-β1激活劑處理。甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期;蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白（CyclinD1）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表達(dá)。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，0.2、0.4、0.8 U/mlBTXA顯著降低增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力和PCNA蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白對(duì)照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml的BTXA顯著提高增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡率（P<0.05）。與空白對(duì)照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml的BTXA顯著升高增生性瘢痕成纖維細(xì)胞G0/G1期（P<0.05）;顯著降低細(xì)胞S期、G2/M期和Cyclin D1蛋白表達(dá)（P<0.05）。與空白對(duì)照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml的BTXA顯著降低p-Smad2/3蛋白表達(dá)（P<0.05）。與0.8 U/ml BTXA組比較，0.8 U/ml BTXA+TGF-β1組顯著升高增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力、S期、G2/M期和Cyclin D1、PCNA蛋白表達(dá)（P<0.05）;顯著降低細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞G0/G1期（P<0.05）。結(jié)論：BTXA通過(guò)抑制TGF-β1/Smad通路從而抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞存活，為臨床治療提供了思路。

[關(guān)鍵詞]A型肉毒毒素（BTXA）;TGF-β1/Smad通路;增生性瘢痕;機(jī)制

[中圖分類(lèi)號(hào)]R334+.5? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2022）05-0093-04

To Explore the Inhibitory Effect of Type A Botulinum Toxin on Hypertrophic Scar Based on TGF-β1/Smad Pathway

ZHANG Xue，LAN Dong，NING Shuhua，YU Sisi

（Department of Dermatology and Plastic Surgery，Beijing Chao-Yang Hospital，Capital Medical University，Beijing 100043，China）

Abstract： Objective To investigate the inhibitory effect of botulinum toxin type A （BTXA） on hypertrophic scar fibroblasts and its mechanism through TGF-β1/Smad pathway. Methods The hypertrophic scar fibroblasts were cultured in vitro， and the fibroblasts were treated with 0.2， 0.4， and 0.8 U/ml BTXA， respectively， as the 0.2 U/ml BTXA group， 0.4 U/ml BTXA group， and 0.8 U/ml BTXA group. The blank control group was not treated with BTXA （0 U/ml）. The 0.8 U/ml BTXA+TGF-β1 group was treated with 0.8 U/ml BTXA and 10 ng/ml of TGF-β1 activator. Methylthiazolyltetrazole （MTT） method was used to detect cell viability; flow cytometry was used to detect cell apoptosis and cell cycle; Western blot was used to detect cell cycle protein （CyclinD1）， proliferating cell nuclear antigen （PCNA）， Smad2/ 3. p-Smad2/3 protein expression. Results Compared with the blank control group， 0.2， 0.4， 0.8 U/ml BTXA significantly reduced the viability of hypertrophic scar fibroblasts and the expression of PCNA protein （P<0.05）. Compared with the blank control group， 0.2， 0.4， 0.8 U/ml BTXA significantly increased the apoptosis rate of hypertrophic scar fibroblasts （P<0.05）. Compared with the blank control group， 0.2， 0.4， 0.8 U/ml BTXA significantly increased the G0/G1 phase of hypertrophic scar fibroblasts （P<0.05）; significantly reduced the cell S phase， G2/M phase and Cyclin D1 protein expression （P<0.05）. Compared with the blank control group， 0.2， 0.4， 0.8 U/ml BTXA significantly reduced the expression of p-Smad2/3 protein （P<0.05）. Compared with 0.8 U/ml BTXA group， 0.8 U/ml BTXA+TGF-β1 group significantly increased the viability of hypertrophic scar fibroblasts， S phase， G2/M phase and Cyclin D1， PCNA protein expression （P<0.05）， significantly reduce the rate of cell apoptosis and cell G0/G1 phase （P<0.05）. Conclusion BTXA inhibits the survival of hypertrophic scar fibroblasts by inhibiting the TGF-β1/Smad pathway.

Key words： BTXA; TGF-β1/Smad pathway; hypertrophic scar; mechanism

瘢痕是創(chuàng)傷愈合留下的痕跡，在一些個(gè)體中，修復(fù)過(guò)程發(fā)生異常可以導(dǎo)致組織過(guò)度增生而形成增生性瘢痕。增生性瘢痕的形狀不規(guī)則，突出皮面，高低不平[1-2]。臨床表現(xiàn)為淡紅色、暗紅色或褐色，有強(qiáng)烈的瘙癢感，有壓痛。瘢痕邊緣和正常皮膚之間有明顯界限，邊緣呈現(xiàn)圓滑的苔形，無(wú)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)[3-4]。A型肉毒毒素（BTXA）是一種神經(jīng)毒性藥物，在美容外科領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用，具有萎縮、軟化瘢痕的作用[5]。BTXA治療機(jī)體瘢痕增生臨床療效佳，不良反應(yīng)少，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[6]。TGF-β1是目前已知與瘢痕纖維化關(guān)系最密切的一種細(xì)胞因子[7]。Smads蛋白家族是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的TGF-β受體下游信號(hào)蛋白，它將TGF-β受體激活后的信號(hào)從胞漿傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，作用于相應(yīng)的靶基因，從而發(fā)揮作用[8]。本研究主要探討B(tài)TXA對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的抑制作用，并進(jìn)一步分析其抑制機(jī)制與TGF-β1/Smad通路的相關(guān)性。

1? 材料和方法

1.1 材料及來(lái)源：BTXA（購(gòu)于蘭州生物制品研究所）;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司）;胰蛋白酶（購(gòu)自上?？道噬锟萍加邢薰荆?TGF-β1/Smad通路激活劑（購(gòu)自美國(guó)Gibco公司）;甲基噻唑基四唑（MTT）（購(gòu)自美國(guó)Epitmics公司）;BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自北京賽因百奧生物技術(shù)有限公司）;細(xì)胞周期蛋白（Cyclin D1）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、Smad2/3、p-Smad2/3（購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司）;辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司）。

1.2 瘢痕組織：收集2017年9月-2019年11月在筆者醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的臨床燒傷后瘢痕整形手術(shù)患者30例，其中男14例，女16例，年齡15～60歲，病程3個(gè)月～2年。術(shù)中切除瘢痕組織，瘢痕組織處于增生期，且患者均無(wú)用藥史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理醫(yī)學(xué)委員會(huì)同意，患者知情并自愿簽署同意書(shū)。

1.3 方法

1.3.1 增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的制備[9]：將手術(shù)中獲得的增生性瘢痕組織，置于無(wú)菌操作臺(tái)中，用手術(shù)剪將皮下組織徹底去除，保留帶表皮的瘢痕組織，并將瘢痕組織切成1 mm×1 mm的小組織塊，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗干凈后，加入0.25 g/L的II型中性酶，4 ℃過(guò)夜后，再加入3倍體積的2%的I型膠原酶，37 ℃培養(yǎng)2 h，即可獲得單細(xì)胞懸液。1 500 r/min離心10 min，并將離心后的細(xì)胞溶解于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。7 d后首次換液，往后每隔3 d換液1次，大約15 d細(xì)胞基本融合成片，以1：2的比例進(jìn)行傳代，實(shí)驗(yàn)取2～4代。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組：將用上述方法正常培養(yǎng)且不采用BTXA（0 U/ml）處理的成纖維細(xì)胞作為空白對(duì)照組;將采用0.2、0.4、0.8 U/ml的BTXA處理48 h的成纖維細(xì)胞分別作為0.2 U/ml BTXA組、0.4 U/ml BTXA組、0.8 U/ml BTXA組。為探究TGF-β1/Smad通路的作用，將10 ng/ml的TGF-β1激活劑與0.8 U/ml BTXA在培養(yǎng)基中共培養(yǎng)24 h，記作0.8 U/ml BTXA+TGF-β1組。

1.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：收集各組細(xì)胞接種至96孔板（5×103個(gè)/孔），每孔加入20 μl MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，室溫避光振蕩孵育5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)為490 nm處的相對(duì)吸光度值（OD），計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期：取各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl FITC與5 μl PI，室溫振蕩孵育10 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。取各組細(xì)胞（1×106個(gè)/毫升），0.25%胰蛋白酶消化，加入預(yù)冷PBS（500 μl）重懸細(xì)胞，再加入3.5 ml預(yù)冷70%乙醇，充分混勻，置于4 ℃條件下孵育24 h，離心后棄上清，PBS洗滌，棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入RNaseA（50 μl），水浴30 min（37 ℃），加入PI染色液（450 μl），4 ℃孵育30 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.3.5 Western blot檢測(cè)Cyclin D1、PCNA、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表達(dá)：提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量，各組蛋白上樣量60 μg，SDS-PAGE后，經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF上。用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，分別加入相應(yīng)的一抗（1：1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，每次5 min;再加入二抗（1：2 000）室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，定影，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測(cè)定各組蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（xˉ±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 BTXA對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力的影響：與空白對(duì)照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml BTXA組的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力和PCNA蛋白表達(dá)均顯著降低，且BTXA濃度與增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力和PCNA蛋白表達(dá)均呈反變關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1、圖1。

2.2 BTXA對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡率的影響：與空白對(duì)照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml BTXA組的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡率均顯著增加，且隨著B(niǎo)TXA濃度的增加，凋亡率也呈上升趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2、圖2。

2.3 BTXA對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞周期的影響：與空白對(duì)照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml BTXA組增生性瘢痕成纖維細(xì)胞G0/G1期顯著拉長(zhǎng)，且BTXA濃度與細(xì)胞G0/G1期呈正比關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;顯著降低細(xì)胞S期、G2/M期和Cyclin D1蛋白表達(dá)，且BTXA濃度與細(xì)胞S期、G2/M期和Cyclin D1蛋白表達(dá)均呈反變關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3、圖3。

2.4 BTXA對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smad通路的影響：與空白對(duì)照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml BTXA組p-Smad2/3蛋白表達(dá)均顯著降低，且BTXA濃度與p-Smad2/3蛋白表達(dá)呈反變關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表4、圖4。

2.5 激活TGF-β1/Smad通路對(duì)BTXA處理的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力、凋亡率和細(xì)胞周期的影響：與0.8 U/ml BTXA組比較，0.8 U/ml BTXA+TGF-β1組增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力、S期、G2/M期和Cyclin D1、PCNA蛋白表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞G0/G1期均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表5、圖5。

3? 討論

增生性瘢痕是以膠原過(guò)度沉積于真皮和皮下組織為特征的皮膚膠原性疾病。臨床上針對(duì)該疾病有很多的方法治療，目前越來(lái)越多的注射類(lèi)藥物在增生性瘢痕的治療中起到了重要作用[10]。BTXA是一種神經(jīng)毒性藥物，它是肉毒梭菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的一種細(xì)菌外毒素，其重鏈可與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)終板上的乙酰膽堿受體高親和力結(jié)合，毒素通過(guò)受體介導(dǎo)的胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[11]。近期的研究結(jié)果顯示，BTXA能有效抑制增生性瘢痕體積，使皮膚表面組織變軟、產(chǎn)生松弛，改變攣縮程度改變[12]。

本研究表明，與空白對(duì)照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml的BTXA顯著降低增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力和細(xì)胞周期;顯著提高增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡率。周海洋等[13]研究表明，BTXA可有效改善增生性瘢痕的情況，且具有一定安全性。武鳳蓮等[14]研究表明，BTXA可抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，并促進(jìn)凋亡，具有劑量和時(shí)間依賴性。張雪等[15]研究表明，BTXA呈計(jì)量依賴性明顯抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力和細(xì)胞周期，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。陶諫等[16]研究表明，注射BTXA可以降低瘢痕增生的程度從而改善額部傷口縫合后的美容效果。宋黎等[17]研究表明，BTXA注射可有效性及安全性的預(yù)防面部創(chuàng)傷或術(shù)后增生性瘢痕。劉斌等[18]研究表明，BTXA治療瘢痕增生的療效和安全性具有非常重要的臨床意義。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，0.2、0.4、0.8 U/ml的BTXA顯著降低p-Smad2/3蛋白表達(dá)。劉昌玲等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中，Smurf2通過(guò)泛素化降解Smad7，削弱了Smad7對(duì)TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用，從而增強(qiáng)了TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與了增生性瘢痕的形成。熊維等[20]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是增生性瘢痕關(guān)鍵通路，Smad是治療增生性瘢痕的生物靶點(diǎn)之一。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與0.8 U/ml BTXA組比較，0.8 U/ml BTXA+TGF-β1組顯著升高增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活力、S期、G2/M期和CyclinD1、PCNA蛋白表達(dá);顯著降低細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞G0/G1期。說(shuō)明，BTXA通過(guò)抑制TGF-β1/Smad通路可抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖。尚念勝等[21]研究發(fā)現(xiàn)，BTXA通過(guò)TGF-β1/Smad通路和ERK通路表達(dá)抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、侵襲和血管形成，并減少膠原蛋白積累。有類(lèi)似的研究發(fā)現(xiàn)，青川復(fù)合物通過(guò)TGF-β1/Smad蛋白信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞發(fā)揮作用[22]。山豆根醇提取物干預(yù)TGF-β1/Smad通路抑制兔耳增生性瘢痕[23]。

綜上所述，BTXA通過(guò)抑制TGF-β1/Smad通路從而抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞存活，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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[收稿日期]2020-01-18

本文引用格式：張雪，蘭東，寧淑華，等.基于TGF-β1/Smad通路探討A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕的抑制作用及機(jī)制[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2021，31（5）：93-97.