超高效液相色譜-串聯質譜法測定牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇殘留量的方法優化

鐘名琴 陳彤 丁燕玲 黃婷 何玉榆 譚磊

摘? 要：建立了一種超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇殘留量的分析方法。樣本經乙腈提取、無水硫酸鈉除水后離心，將上層提取液用氮氣吹至近干，乙腈溶解后直接經超高效液相色譜-串聯質譜儀分析。α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇在1.00 ng/mL～50.0 ng/mL內具有較好的線性關系，相關系數均為0.999 5;α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的方法檢出限分別為9.22×10-2 μg/kg、6.28×10-2 μg/kg;平均回收率分別為81.5%～105.0%和86.7%～97.0%，相對標準偏差分別為4.3%～6.9%和1.8%～5.6%。結果顯示該方法靈敏度好，準確度高，操作步驟簡單，檢測時間大大縮減至2 h，且有效減少了其他方法中用易揮發性無水乙醚提取時出現的乳化現象及對操作人員的傷害，適用于牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的檢測。

關鍵詞：α-玉米赤霉醇;β-玉米赤霉醇;牛奶;超高效液相色譜-串聯質譜法

作者簡介：鐘名琴（1992— ），女，碩士，主要從事農產品及農業投入品監測工作

*通信作者：譚磊，碩士，高級獸醫師，主要從事獸藥殘留檢測與風險評估工作;E-mail： 157197202@qq.com

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，牛奶的銷量也不斷增加，能為人類提供蛋白質、維生素和鈣等營養物質。玉米赤霉醇是人工合成的非類固醇同化性激素，曾被官方批準用于畜牧業生產[1]，用來提高畜禽的飼料轉化率[2]，促進它們的生長[3]。然而，農產品在生長期間，飼料和農產品在加工、貯藏、運輸過程中，均易造成玉米赤霉醇類藥物污染。當給奶牛飼喂受到污染的飼料時，飼料中的玉米赤霉醇等可通過血-乳屏障進入到牛奶中，導致食用牛奶含有玉米赤霉醇類藥物，并通過食物鏈在人體內蓄積，影響和破壞人畜的生長發育及生殖系統等。這不僅會給畜牧業及養殖業造成嚴重的經濟損失，也會對食品安全構成嚴重威脅，因此已成為各地政府關注的問題。20世紀80年代左右，毒理學研究表明，這類藥物會引發癌癥。為了防止這些激素隨畜產品進入人體，各國陸續頒布法令，禁止在畜牧業生產過程中使用。中華人民共和國農業農村部第250號公告明確規定，在食品生產動物的飼養中禁止使用玉米赤霉醇，所產出的所有可食用動物產品不得檢出[4]。

為有效監督牛奶質量安全，建立一種快速、可靠、準確、靈敏的玉米赤霉醇殘留量的分析方法具有重要意義。目前，玉米赤霉醇類藥物的測定方法有薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）[5]、酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunoassay，ELISA）[6]、氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[7]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[8]和液相色譜-串聯質譜法（liquid chromagraphy-mass spectrometry，LC-MS/MS）等[9-11]，雖然相關文獻已報道可用LC-MS/MS測定牛奶中的玉米赤霉醇，但是大多數檢測方法存在操作復雜、提取效果差、回收率低的缺點。

本方法優化并建立了一種超高效液相色譜-串聯質譜法來檢測牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的殘留量。該方法簡便可靠、靈敏度好、準確度高，無需經過凈化可直接上機測定，有效解決了傳統標準方法，例如，GB/T 23218-2008中前處理過程繁瑣[12]，易揮發性無水乙醚作為提取試劑具有提取分離效果差、對操作人員身體健康造成較大危害的缺陷，從而為食品安全和人們身體健康提供保障。

1? 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Aglient 1290超高效液相色譜儀、配有電噴霧（ESI）離子源的AB Sciex Triple QuadTM 5500 質譜儀（美國AB Sciex公司）、N-EVAP-24型全自動氮吹儀、IKA旋渦混合器、梅特勒PL602E型天平、Sigma 3-30KS離心機、Milli-Q Integral 3 型超純水儀、奧特賽斯AS 系列超聲波清洗機、CEM PHOENIX微波馬弗爐。

1.1.2 藥品與試劑

乙腈（色譜純）、無水硫酸鈉（分析純，使用前需540 ℃烘干8 h）等。

α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇：純度高于90.0%，均為德國Dr. Ehrenstorfer公司產品。

1.2 樣本制備

取代表性樣本約500 g，混勻，裝入潔凈容器，密封，標記。在抽樣及制備的操作過程中，應防止樣本收到污染或發生殘留物含量的變化。并將試樣于0 ℃～4 ℃保存。

1.3 標準儲備液和混合標準工作液的配制

準確稱取α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的標準品，分別用乙腈溶解并稀釋成濃度為1.00 mg/mL的標準儲備液，-18 ℃以下冷凍避光保存6個月。再分別移取適量上述各物質標準儲備液，用乙腈逐級稀釋成適當濃度的混合標準工作液。

1.4 樣本前處理

準確稱取牛奶樣本2.0 g±0.02 g于? ?50 mL離心管中，加入10 mL乙腈后立即渦旋搖勻，再加入4 g無水硫酸鈉，渦旋混勻4 min，超聲提取10 min，4 ℃ 9 000 r/min離心8 min，吸取上清液，氮吹近干，用1.00 mL乙腈復溶，過0.22 μm有機相濾膜后，可直接上機測定。

1.5 UPLC-MS/MS條件

1.5.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，3.0 mm×100 mm）;流動相A為純水;流動相B為乙腈（色譜純）;柱溫40.0 ℃;進樣體積5.00 μL。具體梯度洗脫程序見表1。

1.5.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源;掃描方式：負離子掃描;檢測方式：多反應監測（multiple-reaction monitoring，MRM）;電噴霧電壓： -4.5 kV;離子源溫度：500 ℃;氣簾氣壓力：35.0 psi;碰撞氣壓力：9 psi;霧化器壓力：55.0 psi;輔助加熱器壓力：55.0 psi。

保留時間、定性離子對、定量離子對、去簇電壓及碰撞能量見表2。

空白基質分別添加10.0 μg/kg α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的色譜圖見圖1。

2? 結果與討論

2.1 標準曲線

準確稱取5個牛奶空白基質樣本，按“1.4 樣本前處理”的方法處理，獲得空白樣本提取液。將空白樣本基質配制成不同濃度系列的混合標準工作溶液（質量濃度依次為：1.00 ng/mL、? ? ? ? 2.00 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL）。按方法條件設置儀器參數，待儀器穩定后供超高效液相色譜-串聯質譜儀測定，并繪制標準工作曲線。可發現基質試驗峰面積與相應回收濃度的線性關系好，其中α-玉米赤霉醇的相關系數為r=0.999 5，β-玉米赤霉醇的相關系數為r=0.999 5，具體見表3。

2.2 方法檢出限確定

以空白牛奶樣本為基質，做七個平行添加試驗，牛奶中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的陽性添加濃度均為1.00 μg/kg，按照1.4進行前處理，進行上機測定。根據各樣本檢測值計算出平均值X及標準偏差Sb，按公式檢出限（MDL）=（k×Sb×C）/X（k為置信因子，一般取3;C為理論加標水平，單位為μg/kg）計算，測得α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的方法檢出限分別為9.22×10-2 μg/kg、6.28×10-2 μg/kg，見表3。

2.3 方法回收率和精密度驗證

用空白牛奶基質樣本分別對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇進行3個不同濃度水平的添加回收實驗，每個水平均取6個平行樣，陽性添加濃度分別為1.00 μg/kg、2.00μg/kg、10.0 μg/kg。按“1.4 樣本前處理”的方法進行處理，處理好的樣本供超高效液相色譜串聯質譜測定。牛奶樣本中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的平均回收率和相對標準偏差結果詳見表4。

由表4可知，該方法的回收率較好，牛奶中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的回收率分別為81.5%～105.0%、86.7%～97.0%，相對標準偏差均小于7.0%，說明該方法重復性好、定性、定量準確，并且峰形受基質的干擾比較小。

3? 結論

本方法旨在建立一種牛奶中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的超高效液相色譜-串聯質譜簡便測定方法，為相關監管部門監管快速、準確測定牛奶中該類藥物提供方法參考和技術支持。試驗結果表明，該方法可以在很大限度上減少樣本前處理時間，方法靈敏度及準確度高，提取分離度好。與傳統的方法相比，該方法采用乙腈直接提取的方式極大限度提高了檢測效率，可適用于牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇殘留量的定性、定量檢測。

參考文獻

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