蛋白酶的研究歷史、發現及在健康和疾病中的作用(續1)

范美紅譯 王晶晶審

摘? 要：《生物化學雜志》（Journal of Biological Chemistry，JBC）一直是傳播和記錄蛋白酶發現和特性的主要載體。1971-2010年，在Herb Tabor博士擔任JBC主編期間，蛋白酶領域的研究取得了快速的發展。當他開始任職時，只有少數蛋白酶的精細結構和動力學為人所知。現在，人們已對數千種蛋白酶進行了鑒定，在人類基因組中發現了600多個蛋白酶基因。本綜述除了回顧Herb Tabor博士對JBC以及美國生物化學和分子生物學學會（American society for biochemistry and molecular biology，ASBMB）在蛋白酶研究中所起的可貴貢獻外，筆者還盡力概述了蛋白酶領域的研究歷史，重點介紹了在蛋白酶研究過程中的一些發現及其在動物體內的作用。此外，本綜述還討論了金屬蛋白酶，特別是龍蝦肽酶家族中穿膜肽酶（meprin）的結構特征、調控、作用機制以及在動物健康和疾病中的作用。蛋白酶和蛋白質降解作用在生命系統中起著至關重要的作用，筆者還簡要介紹了這一高度多樣化和蓬勃發展的研究領域的未來方向。

關鍵詞：蛋白酶;金屬蛋白酶;研究歷史;作用機制;結構特征;生理功能

3? 金屬蛋白酶特性和生理功能的研究進展

金屬蛋白酶已經成為一組引人關注的酶。它們存在于所有生物界中，并在進化過程中廣泛擴展。1980年，研究人員共鑒定出11種金屬蛋白酶。目前，已知小鼠和人類的基因組編碼了大約200種金屬蛋白酶，是蛋白酶領域中最大的一組酶。這些酶中大多數由細胞分泌或與質膜相結合，在細胞周圍和細胞外發揮作用。在胚胎發育過程中，它們參與組織的分化和重塑，在成年組織中參與加工具有生物活性的肽和細胞因子。用于控制血壓的血管緊張素轉化酶抑制劑是人類使用最廣泛的抑制劑之一。金屬蛋白酶還與許多疾病有關，如癌癥和炎癥性疾病。它們和其抑制劑（如金屬蛋白酶組織抑制劑）具有很大的醫學價值，臨床試驗結果既讓人樂觀，又讓人失望。利用金屬蛋白酶的合成抑制劑來抑制癌細胞的轉移為人類戰勝癌癥展現了巨大的希望，但尚未發揮其潛力。

鋅金屬蛋白酶超家族包含大多數已知的金屬內切蛋白酶（在蛋白質底物內部裂解肽鍵的含鋅酶）。該超家族由六個相關的進化家族組成：解聯蛋白和金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinases，ADAMs）、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、妊娠相關血漿蛋白酶、沙雷菌蛋白酶、利什曼原蟲表面蛋白酶（leishmanolysins）和龍蝦肽酶。這些酶家族中的每一個家族都有多個單獨的酶，并且在發現和生理功能上都有極具吸引力的故事。有趣的是，不同家族的蛋白酶結構域在氨基酸序列上具有相對較低的相似度。然而，所有的催化結構域都具有驚人相似的三維結構，活性位點有一個保守的鋅結合結構域[HEXHXX（G/N）XX（H/D）]以及一個保守的甲硫氨酸轉角（Met-turn）。下面將重點討論龍蝦肽酶家族，特別是該家族的穿膜肽酶。

龍蝦肽酶家族是20世紀80年代和90年代進行大量克隆和測序的結果。通過序列相似性鑒定，該家族最初的成員包括：龍蝦肽酶，來自人骨的骨形態發生蛋白-1（bone morphogenetic protein-1，BMP-1），來自小鼠腎臟和人類腸道的穿膜肽酶，來自非洲爪蟾胚胎部分序列的UVS.2 （uterine-egg viteline envelope soluble）。之所以命名為“龍蝦肽酶家族”，是因為奧斯塔歐洲螯蝦（Astacus astacus）的龍蝦肽酶是該家族中第一個被測序和描述的酶。龍蝦肽酶存在于動物和細菌中，目前還沒有在植物和真菌中發現。隨著對許多物種的基因組測序，已經發現了數百種的龍蝦肽酶。在人類和小鼠的基因組中，已經發現了6個龍蝦肽酶家族基因，其中包括2個穿膜肽酶基因、3個骨形態發生蛋白-1（bone morphogenetic protein-1，BMP-1）/tolloid樣基因和1個ovastacin基因。在黑腹果蠅和秀麗隱桿線蟲中，分別發現了16種和40種龍蝦肽酶。在黑腹果蠅和秀麗隱桿線蟲中，大多數龍蝦肽酶基因的功能尚未確定，但在寄生線蟲中，龍蝦肽酶參與蛋白質在細胞外基質中的移動，在水螅中參與頭部再生。

在已描述的龍蝦肽酶中，螯蝦的龍蝦肽酶分子量最小，含有一個200個氨基酸殘基的催化結構域。從cDNA測序中得知，在蛋白質合成過程中有一個前原（prepro）序列被切割。到目前為止，在所有測序的龍蝦肽酶家族成員中都發現了前（pre）序列或信號序列，估計是為了引導蛋白質進入內質網和分泌途徑。原序列（pro sequence）作為一種調節機制，能使酶失去活性。活性螯蝦蛋白只含有一個約20 kDa的催化結構域，而大多數龍蝦肽酶家族成員含有一個或多個非催化結構域，位于蛋白酶結構域的C端。許多含有一個或多個表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）樣結構域，以及一個CUB（補體亞組分Clr/Cls、胚胎海膽蛋白UEGF、BMP-1）結構域。這些對蛋白與蛋白或蛋白與底物之間的相互作用很重要。非催化結構域是造成家族成員大小不一的原因，大小從200個氨基酸（小龍蝦龍蝦肽酶）到900個氨基酸（小鼠BMP-1）不等。此外，許多更復雜的龍蝦肽酶是高度糖基化的蛋白質，進一步提高了分子質量和復雜性。

龍蝦肽酶家族成員——穿膜肽酶是一類獨特的寡聚金屬蛋白酶，包含兩個進化上相關的α和β亞基的同源和異源寡聚體。它們體現了鋅金屬蛋白酶超家族成員的復雜性。

穿膜肽酶發現于1980年，是在糖尿病小鼠中尋找蛋白酶的結果。在由鏈脲霉素誘導的糖尿病BALB/c小鼠中尋找蛋白酶活性和蛋白質周轉變化的過程中，使用各種底物測量了肝臟、腎臟和肌肉組織中的蛋白酶活性。與對照組小鼠相比，在糖尿病小鼠組織中測量的肝臟降解率或蛋白酶活性沒有發現根本變化。然而，研究發現，在堿性條件（pH9）下，以偶氮酪蛋白（azocasein）為底物時，這些小鼠的腎臟具有相對高的活性。然后，從BALB/c小鼠腎臟中純化了這種酶，發現它是一種糖基化的膜結合金屬蛋白酶，α亞基分子質量為85 kDa～90 kDa。該亞基形成二硫鍵二聚體，二聚體形成320 kDa的四聚體。Sterchi等（1982）報道了人體中與小鼠穿膜肽酶相當的一種名為對氨基苯甲酸（para aminobenzoic acid，PABA）肽酶（以水解底物命名）的腸道酶，但這兩種酶之間的相似性直到它們被克隆和測序后才被發現。

1983年，BALB/c小鼠有一段時間無法使用，筆者實驗室從另外兩個近交系C3H/He小鼠和CBA小鼠中收集腎臟。與BALB/c小鼠相比，這些小鼠腎臟中的偶氮酪蛋白酶（azocaseinase）活性非常低。因此，Beynon（1983）撰寫了一篇闡述多種C系小鼠缺陷的論文。梅奧醫學中心的小鼠免疫遺傳學家Chella David注意到了該論文，他告訴筆者，許多C系小鼠是為移植研究培育的，在主要組織相容性復合體基因上存在差異。這些觀察結果促使相關研究人員開展合作，并發現小鼠17號染色體上靠近主要組織相容性復合體的一個基因（Mep-1a）能夠調控小鼠腎臟中穿膜肽酶活性的表達水平。現在已知，Mep-1a可編碼穿膜肽酶的α亞基。對缺陷型或穿膜肽酶低活性小鼠品系的進一步研究顯示，它們表達的是含有β亞基的穿膜肽酶的潛伏形式。穿膜肽酶的β亞基與α亞基在催化結構域上具有58%的相似性，并由小鼠18號染色體編碼，這是一個由單一基因分化進化的例子。對不同品系小鼠的穿膜肽酶α亞基和β亞基的研究發現，穿膜肽酶α亞基與β亞基在小鼠腎臟中有幾種不同的組合，形成穿膜肽酶的四級結構，以及穿膜肽酶的A和B異構體，分別為EC 3.4.24.63和EC 3.4.24.18。尚不清楚造成一些近交系小鼠成年后缺乏穿膜肽酶α亞基表達的原因，但已知這受進化的調控，因為所有小鼠品系在胚胎期和青春期前腎臟都能表達穿膜肽酶α亞基和β亞基。

20世紀80年代對穿膜肽酶的研究是利用從成年小鼠腎臟刷狀緣膜中分離的蛋白質進行的。在偶氮酪蛋白酶活性高的小鼠體內，穿膜肽酶含有α和β亞基，而在該酶活性低的小鼠（缺陷型品系）體內，穿膜肽酶只含有β亞基。這種小鼠的穿膜肽酶α亞基在質膜上是有活性的，而β亞基主要是潛伏的，但可以被類胰蛋白酶激活。對穿膜肽酶α亞基激活的研究表明，去除原序列可以形成包括兩個N端殘基的氫鍵，這對酶的結構至關重要。隨著20世紀80年代和90年代分子生物學的發展，特別是克隆、測序和定向誘變等技術的發展，對穿膜肽酶α亞基結構和功能的研究取得了快速的發展。

穿膜肽酶異構體的結構相當復雜，具有多域、多聚體結構。寡聚體由穿膜肽酶α亞基和/或β亞基的二硫鍵連接的二聚體組成，這些二聚體可能會自聯，形成分子質量更大的異構體。同源穿膜肽酶Α只含有α亞基，異源穿膜肽酶Α含有α亞基和β亞基，而同源穿膜肽酶B只含有β亞基。兩個亞基都是糖基化的，天冬酰胺連接糖對二硫鍵的形成、低聚反應、穩定性、分泌和酶活性很重要。至于結構域結構，兩個亞基都含有一個信號序列、原序列、蛋白酶（催化）結構域、甲基偶氮甲醇（methylazomethanol，MAM）結構域、腫瘤壞死因子受體相關因子（tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF）結構域、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）樣結構域、跨膜結構域和C端小尾巴（6～26個氨基酸）。非催化結構域對蛋白酶的運輸、結構和活性很重要。α亞基和β亞基結構域的一個明顯區別是，穿膜肽酶α亞基在EGF樣結構域和TRAF結構域之間含有一個I（插入的）結構域，而β亞基沒有。在分泌途徑的成熟過程中，I結構域內有一個蛋白酶切，導致該亞基從膜上釋放出來。通過定點誘變將I結構域從穿膜肽酶α亞基中移除，結果顯示I結構域對于蛋白質水解和亞基從膜上釋放是必要和充分的。因此，只含有穿膜肽酶α亞基的穿膜肽酶異構體被分泌到細胞外。二硫鍵連接穿膜肽酶α亞基二聚體往往會以非共價鍵結合成1 MDa～6 MDa的高分子質量復合物，其是生物系統中分泌的最大的蛋白酶復合物之一。這種自聯作用使單體穿膜肽酶A集中在細胞外環境中，并且可能對穩定性和作用很重要，特別是在感染部位和腸道的惡劣環境中。與細胞膜相關的穿膜肽酶都含有穿膜肽酶β亞基，可能由穿膜肽酶β亞基二硫鍵連接二聚體、形成四聚體的穿膜肽酶α亞基/β亞基二聚體或與穿膜肽酶α亞基二聚體非共價結合的穿膜肽酶α亞基/β亞基二聚體組成。對穿膜肽酶β亞基二聚體的交聯研究揭示了蛋白質內有一個域間和域內接觸的緊湊結構，包括TRAF-TRAF相互作用。人類穿膜肽酶B的X射線結構顯示，活性位點靠近膜，這對該亞型的脫落活性有影響。

穿膜肽酶在腎臟和腸道刷狀緣膜上的定位最初是通過細胞分級分離研究和隨后的免疫組織化學研究推斷出來的。穿膜肽酶也在白細胞中表達，對這些細胞的研究表明，在敲除穿膜肽酶β亞基基因的小鼠中，這些細胞通過細胞外基質的能力減弱。穿膜肽酶在單核細胞和自然殺傷細胞中的表達，會影響這些細胞的內穩態。人類穿膜肽酶α亞基和β亞基在表皮的不同層中表達，并參與細胞增殖和人類皮膚細胞的終末分化。研究發現，胰腺、睪丸、胎兒肝臟、胚胎干細胞和腦組織中都檢測到了穿膜肽酶亞基的mRNA，其中表達水平最高的是腎臟和腸。因此，研究人員主要在這些組織中研究穿膜肽酶的生理功能。通過構建基因敲除小鼠，同時對小鼠進行挑戰，研究已經收集到關于穿膜肽酶生理功能的其他見解。

穿膜肽酶能夠水解各種底物，從肽到蛋白質。小鼠穿膜肽酶B對裂解部位的酸性殘基有明顯的偏好。相比之下，同源穿膜肽酶A更喜歡裂解含有小的或疏水氨基酸殘基的鍵。這些偏好導致肽底物的水解作用存在明顯差異。例如，穿膜肽酶B可以裂解促胃液素和骨橋蛋白，但穿膜肽酶A不能，穿膜肽酶A可以裂解緩激肽和P物質，但穿膜肽酶B不能。穿膜肽酶B還可以裂解細胞表面蛋白，如E-鈣黏蛋白和上皮細胞鈉通道，從而影響細胞與細胞的相互作用和離子運輸。穿膜肽酶A可裂解緊密連接蛋白——閉合蛋白，這會損害上皮屏障功能，增強單核細胞遷移。穿膜肽酶異構體對細胞因子的激活和降解也有不同的偏好，穿膜肽酶異構體的平衡可能對細胞因子譜和炎癥反應進程有重要影響。在尋找人類穿膜肽酶的底物時，高通量技術發現了許多底物以及穿膜肽酶與ADAMs之間有趣的聯系。

充分的證據表明，穿膜肽酶與一些疾病有關，這將是未來需要探索的領域，并有望治愈這些疾病。例如，穿膜肽酶存在于炎癥部位，會影響白細胞的遷移，降解緊密連接蛋白，并激活/降解細胞因子。利用穿膜肽酶α基因敲除小鼠進行的研究發現，在腸道疾病模型中，穿膜肽酶α亞基表達減少增加了腸道的炎癥反應。此外，人類甲基多巴α亞基基因是炎癥性腸病，特別是潰瘍性結腸炎的易感基因。穿膜肽酶還會影響小鼠尿路感染進程。對小鼠的其他研究表明，穿膜肽酶與腎臟疾病的發病機制有關，人類甲基多巴β亞基基因的多態性與比馬印第安人的糖尿病腎病有關。穿膜肽酶在各種癌（如結腸癌和乳腺癌）細胞中都有表達，研究認為其在腫瘤細胞侵襲和遷移中起著一定的作用。研究還發現，穿膜肽酶在體內能裂解淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP），這意味著其在神經退行性疾病，如阿爾茨海默癥的發生上起著一定的作用。最近對穿膜肽酶與腸道中黏蛋白相互作用的研究發現，它在保護宿主上皮細胞免受細菌侵害和影響腸道菌群組成方面發揮著一定的作用。

4? 小結

未來的挑戰之一是了解蛋白酶在生物體內的功能，并能在特定組織中選擇性地激活和抑制它們。蛋白酶存在于其他分子和蛋白酶的網絡環境中，存在于細胞間、細胞膜和細胞外環境中，這些環境無疑在測定其功能上至關重要。大系統理論，如結合運用遺傳學、細胞生物學以及蛋白質組學來鑒定底物和活性蛋白酶的降解組學，將是了解和調控蛋白酶系統所必需的。Herb Tabor為JBC打下了基礎，研究從單種酶的鑒定和特性描述進入了復雜的多組分系統，以闡明蛋白酶在生命結構中的作用。

（續完）

原題名：Proteases： history， discovery， and roles in health and disease（英文）

原作者：Judith S. Bond1