重度低溫誘導大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路活化研究

竇建平，王 寧，劉麗麗，李 軍

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是指細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)由于未折疊或錯誤折疊蛋白積累而產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)。因此，也常被稱為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)。在生理條件下，ERS 傳感器蛋白主要包括蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PRKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK）,肌醇需求酶1α（serine/threonine-protein kinase/endoribonuclease inositol-requiring enzyme 1，IRE-1α）和 活 化 轉(zhuǎn) 錄 因 子6（Activating Transcription Factor6,ATF6），這些感受器被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（the immunoglobulin heavy chain binding protein，BIP）結(jié)合并保持在非活性狀態(tài)。一旦發(fā)生ERS，這些傳感器蛋白就會從Bip中分離出來，激活下游信號通路，抑制蛋白的翻譯，上調(diào)分子伴侶蛋白以增強蛋白折疊能力，并/或通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑促進未折疊或錯誤折疊蛋白的降解。

目前，關(guān)于ERS的研究主要集中在三條主要信號通路，包括PERK-eIF-2α-ATF4通路、IRE-1-XBP1通路和ATF6通路。根據(jù)ERS的嚴重程度和持續(xù)時間，UPR 可以誘導細胞不同的結(jié)局，可以觸發(fā)適應(yīng)性，也會誘導促凋亡反應(yīng)，以此來最大程度減少細胞進一步損傷[1-3]。

到目前為止，很多研究顯示ERS參與急性腎損傷（acute renal injury,AKI）的發(fā)病機制。較長時間中度及重度的低溫，由于心輸出量減少進而引起腎小球濾過率下降，腎血流量下降，最終引起類似急性腎損傷、腎功能不全的表現(xiàn)[4]。目前，大多數(shù)研究主要集中在治療性或保護性低體溫上，即利用輕度低溫來對抗損傷因素，比如對抗缺血/缺氧（這些低溫多為局部低溫）。針對重度全身性低溫引起的繼發(fā)性腎損傷研究還較少，但是對于軍隊人員，由于各種復雜軍事環(huán)境及熱量供應(yīng)不足，極易產(chǎn)生低溫，影響戰(zhàn)斗力。為了了解全身重度低溫條件下腎臟損傷的機制，為未來戰(zhàn)場低溫救治提供治療依據(jù)，我們開展了相關(guān)研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 健康清潔級雄性SD 大鼠24只，體質(zhì)量200～250 g。由軍事醫(yī)學研究院動物實驗中心提供。按照處理方法不同隨機分為3 組，每組8 只，分別為對照組（C 組）、輕度低溫組（MH 組）和重度低溫組(SH組)。

1.2 實驗方法

1.2.1 低溫大鼠模型制備方法 大鼠稱重后給予2% 戊巴比妥鈉（Sigma 公司）腹腔內(nèi)注射麻醉（30 mg/kg）。所有大鼠胸部以下備皮。C 組大鼠僅麻醉后仰臥位固定45 min。利用低溫水槽（貝朗）控制大鼠體溫。根據(jù)低溫標準，選擇將中度低溫組（MH 組）大鼠浸泡水溫控制在34 ℃，重度低溫組（SH 組）大鼠浸泡水溫控制在30 ℃。動物研究體溫儀（Bioseb）放置入大鼠食道，每隔5 min 記錄核心體溫。低溫時間持續(xù)60 min。實驗結(jié)束后12 h，取材，腎臟組織放于液氮中儲存。

1.2.2 Western 印跡實驗 腎臟組織樣本研磨好后加入組織蛋白裂解液（北京普利萊公司）。裂解后4 ℃、離心10 min。吸取上清后進行蛋白質(zhì)定量測定。蛋白表達采用相對定量，即將所有條帶均與肌動蛋白（β-actin，F(xiàn)ermentas公司）的光密度比值相除得到的相對比值。主要的目的蛋白包括：Anti-PERK、Anti-p-PERK、Anti-IRE-1、Anti-p-IRE-1、Anti-Bip 及Anti-CHOP 抗體（CST），Anti-CIRP 抗體（Abcam），Anti-HSP70抗體（Abcam）。

1.2.3 免疫組化染色 石蠟切片脫蠟，置于載玻片上，用10%山羊血清封閉，室溫孵育10 min。用0.1%Triton X-100 在室溫下透化1 h，加一抗，4 ℃孵育24 h，PBS 清洗，加二抗，室溫下再孵育2 h，用DAB染色，封片，顯微鏡下觀察。

1.3 觀察指標 觀察大鼠ERS 通路相關(guān)蛋白包括PERK，p-PERK，IRE-1，p-IRE-1，CHOP，Bip 等分子及熱休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）及冷誘導的RNA 結(jié)合蛋白（Cold-inducible RNA-binding protein,CIRP）的表達。有研究顯示熱休克蛋白是腎臟缺血再灌注損傷響應(yīng)程度最高的反應(yīng)物[5]，CIRP 在諸如體溫過低，缺氧，紫外線輻射等壓力條件下也會上調(diào)和分泌[6]。

1.4 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 24.0 進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)的差異性比較采用方差分析，經(jīng)方差分析確定存在差異的多組均數(shù)之間的兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動物降溫曲線 首先利用低溫水槽對大鼠進行降溫處理，如圖1 所示。MH 組體溫基本在浸泡后5 min 達到目標體溫，隨后上下輕微波動。整個降溫過程持續(xù)60 min，其中MH 組大鼠體溫保持在34 ℃。SH 組大鼠體溫保持在30 ℃。三組大鼠體溫差異具有統(tǒng)計學意義。

圖1 三組大鼠的降溫曲線

2.2 低溫大鼠熱休克蛋白70（HSP70）及冷誘導的RNA 結(jié)合蛋白（CIRP）活化情況 本研究顯示，HSP70 在兩種低溫條件下，即輕度低溫組（MH 組）和重度低溫組（SH 組）均有較明顯活化，CIRP 蛋白在重度低溫組（MH 組）活化更加顯著，差異具有統(tǒng)計學意義。見圖2。

圖2 大鼠腎臟熱休克蛋白70（HSP70）及冷誘導的RNA結(jié)合蛋白（CIRP）表達情況（*表示P＜0.05;**表示P＜0.01；***表示P＜0.001）

2.3 不同低溫條件下大鼠腎臟ERS 通路相關(guān)蛋白表達變化 不同低溫會引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路活化有所差異。MH 組和SH 組的低溫狀態(tài)會活化PERK 以及IRE-1，表現(xiàn)為磷酸化PERK（p-PERK）以及磷酸化IRE-1（p-IRE-1）表達上調(diào)。其中，p-PERK 隨著低溫程度的加重，磷酸化水平逐漸升高。而IRE-1在輕度低溫條件下就可以出現(xiàn)明顯的磷酸化水平升高。Bip 是一種重要的分子伴侶，也稱為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulating protein，GRP78）。是HSP70家族成員，Bip的增加是ERS活化的標志。本研究提示在正常條件下，Bip僅有極少量表達，輕度低溫和重度低溫均會導致Bip 的活化，兩組活化程度相似。CHOP 蛋白是ERS 過程中活化的促凋亡蛋白，在ERS誘導的細胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用[7]。本研究顯示，僅有重度低溫會誘導CHOP高表達。見圖3。

圖3 不同低溫條件下大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路活化情況（*表示P＜0.05;**表示P＜0.01；***表示P＜0.001）

2.4 大鼠腎臟CHOP 蛋白免疫組化染色 腎小管是對缺血缺氧比較敏感的部分，對照組可以觀察到，CHOP 蛋白主要表達在腎小管區(qū)域。輕度低溫后，腎小管管腔擴張，小管腫脹，細胞間質(zhì)水腫明顯，細胞排列教對照組紊亂，CHOP 染色變化不明顯。重度低溫組多數(shù)小管正常結(jié)構(gòu)破壞甚至消失，小管塌陷，細胞排列紊亂加重，很多小管出現(xiàn)CHOP表達上調(diào)，提示凋亡增加。見圖4。

圖4 大鼠腎臟CHOP免疫組化染色（Bar=20μm）

3 討論

低溫能夠減少氧氣消耗，防止線粒體活性的快速喪失。盡管很多研究顯示，輕度低溫可能有助于減少缺血的有害影響，但不是所有的低溫都是有益的。中度及重度的低溫，尤其是全身低溫，會對機體產(chǎn)生損傷性作用。由于低溫會導致全身血管收縮，因此腎臟灌注也會下降，而低溫復溫過程和缺血再灌注損傷過程相似。ERS 參與腎臟缺血再灌注損傷機制，為此，我們開展該項研究，觀察ERS是否也參與低溫損傷這一過程。

腎臟發(fā)生損傷后，會激活一系列代償機制減輕細胞損傷，其中一種代償機制就是通過上調(diào)HSP減輕腎損傷，恢復細胞穩(wěn)態(tài)。HSP70 是HSP 家族成員，一些研究表明，HSP70在缺血性腎損傷條件下，可以在受損的腎小管中上調(diào)[8]。因此，近年來，HSP70 不僅作為腎缺血再灌注損傷的一種靈敏的分子標志物，而且，越來越多研究進行了HSP70 在缺血性腎損傷中的作用和功能研究。有研究顯示，HSP70 在AKI 中具有保護作用，HSP70 參與不可逆受損蛋白質(zhì)的降解，通過控制調(diào)節(jié)促凋亡蛋白Bax活性限制腎小管細胞凋亡[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫會導致HSP70表達增加，這提示兩種低溫均會活化腎臟內(nèi)HSP70，誘導低溫應(yīng)激反應(yīng)，啟動保護性機制。和HSP70 不同，體外和體內(nèi)實驗表明，CIRP 是一種DAMP。CIRP 的表達上調(diào)可以通過多種途徑加重損傷，例如，可誘導腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）和高遷移率組盒1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）的水平，從而導致下游炎癥，反過來，抑制CIRP有助于減輕缺血再灌注損傷[10]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，重度低溫活化CIRP更加顯著，這提示和輕度低溫相比，重度低溫引發(fā)了更為嚴重的損傷。

本研究顯示，輕度低溫和重度低溫均會誘導ERS 產(chǎn)生，表現(xiàn)為磷酸化PERK 以及IRE-1 增加。IRE-1是一種核糖核酸內(nèi)切酶。當被激活時，IRE-1可以招募其下游分子，并最終激活其下游靶標c-JunN-末端激酶1（c-JunN-terminalkinase,JNK）。在本研究中，兩種低溫均會活化PERK 以及IRE-1 通路。其中輕度以及重度低溫活化IRE-1 程度類似，但是重度低溫對PERK通路活化更加顯著。

進一步，本研究還發(fā)現(xiàn)，重度低溫會顯著激活CHOP 表達。在分子水平，ERS 會誘導Bip 在內(nèi)的一系列ER 分子伴侶活化，啟動蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)。PERK 會通過磷酸化eIF2α 并導致轉(zhuǎn)錄因子ATF4活化，最終會誘導促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP 蛋白活化。CHOP 也稱為生長停滯和DNA 損傷誘導基因153（GADD153），該蛋白質(zhì)是C/EBD 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。該PERK/ATF4/CHOP 軸是ERS 導致凋亡的關(guān)鍵通路[11-12]。PERK 活化程度和低溫損傷程度呈現(xiàn)一定相關(guān)性，重度低溫p-PERK 活化最顯著，CHOP 蛋白上調(diào)也更加明顯。隨后，利用免疫組化，進一步觀察CHOP 在腎臟重度的分布。通過免疫組化染色除了可以觀察到低溫損傷對腎小管形態(tài)有所破壞以外，還可以觀察到重度低溫組CHOP蛋白表達明顯增加，主要集中在腎小管部分。這些情況提示重度低溫對腎臟的影響可能和嚴重低溫引發(fā)的促凋亡反應(yīng)有關(guān)。

本研究揭示，輕度低溫和重度低溫在活化ERS上有所不同。重度低溫活化PERK 通路活化以及CHOP蛋白表達上調(diào)更加顯著。