駐景丸加減方對形覺剝奪性近視小鼠視網(wǎng)膜自噬的影響

馬 捷，莫 亞，2，葉映含，龍丹寧，鄧睎遠(yuǎn)

0 引言

近年來，近視的患病率在全球范圍內(nèi)呈爆發(fā)性增長且逐漸呈低齡化發(fā)展趨勢，由近視引起的近視視網(wǎng)膜退變也隨之上升[1]，是青年患者首要致盲性眼病。雖然近視形成的確切機(jī)制尚不明確，但已有研究指出近視形成過程與炎癥、氧化反應(yīng)等密切相關(guān)[2]。視網(wǎng)膜中含有大量線粒體，是活性氧(reactive oxygen species,ROS)的重要來源，ROS積累過多可造成蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸的氧化，從而損傷機(jī)體組織。研究表明減少ROS的產(chǎn)生可防止視網(wǎng)膜病變[3]，ROS過多增加則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[4]。自噬是一種基本的分解代謝機(jī)制，主要通過溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器及下調(diào)ROS、炎癥小體等[5]，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[6]。LC3Ⅱ的量與自噬小體數(shù)量密切相關(guān)，可作為觀察細(xì)胞自噬活性的關(guān)鍵指標(biāo)，p62作為自噬受體蛋白，是反映自噬活性的輔助指標(biāo)。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的免疫細(xì)胞之一，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期，可快速清除凋亡的軸突，并啟動(dòng)程序性死亡調(diào)控神經(jīng)元的數(shù)量。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞將發(fā)生活化與遷移[7]。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞將產(chǎn)生對神經(jīng)元有害的ROS、分泌炎癥因子誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡[8]。研究發(fā)現(xiàn)自噬與小膠質(zhì)細(xì)胞聯(lián)系緊密，可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[9-10]。近視，在古籍中被稱之為“目不能遠(yuǎn)視”“能近怯遠(yuǎn)癥”。《審視瑤函》記載本病為“肝經(jīng)不足腎經(jīng)病，光華咫尺視模糊”及“陽不足，病于少火者也”，認(rèn)為近視之病，多因肝腎不足所致。駐景丸加減方，最早源于倪德維的《原機(jī)啟微》，現(xiàn)臨床使用多出自陳達(dá)夫[11]《中醫(yī)眼科六經(jīng)法要》，方中主要含有菟絲子、枸杞子、楮實(shí)子、五味子、茺蔚子、三七等，具有肝腎同補(bǔ)、活血明目的作用。研究發(fā)現(xiàn)駐景丸加減方可激活抗氧化系統(tǒng)與自噬系統(tǒng)，對近視發(fā)展過程中出現(xiàn)的視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)退行性病變具有保護(hù)作用[12-13]。研究表明視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)退行性病變與小膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)[14-15]。綜上,本研究通過建立形覺剝奪性近視(FDM)小鼠模型，探究駐景丸加減方是否通過調(diào)控自噬，達(dá)到干預(yù)近視及近視視網(wǎng)膜退變的目的。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物3周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠30只，體質(zhì)量18±2g，許可證號(hào)：SYXK(川)2019-049，檢查小鼠健康無眼病及皮膚破損，保持實(shí)驗(yàn)室光照12h/d，飼養(yǎng)于(22±2)℃的環(huán)境中，自由攝食和飲水。本研究通過成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查審批(備案編號(hào)：2002-22)。

1.1.2主要試劑與藥品IBa1，小鼠克隆抗體(批號(hào)：GB12105，Servicebio)；LC3Ⅱ抗體，兔克隆抗體(貨號(hào)：A19665，abclonal)；p62抗體，兔克隆抗體[貨號(hào)：ab109012，英國abcam-艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]；IBa1抗體，小鼠克隆抗體(批號(hào)：GB12105，Servicebio)；RNA Trizol Reagent(批號(hào)：vs18061730，合肥博美生物科技有限公司)；駐景丸加減方采用該方制成的我院院內(nèi)制劑補(bǔ)精益視片，每片0.3g(批號(hào)：20200703，成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科)，主要成分為：楮實(shí)子、菟絲子、茺蔚子、五味子、枸杞子、三七等。

1.1.3儀器帶狀檢影鏡(六六視覺醫(yī)療器械有限公司)；A超(KN-1800)；顯微手術(shù)器械(宿遷奕菲電子商務(wù)有限公司)；手術(shù)顯微鏡(合肥密維光學(xué)儀器有限公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀5200(上海天能科技有限公司)；圖像分析軟件Image-J(美國National Institutes of Health)；透射電子顯微鏡：型號(hào)JEM-1400FLASH(日本電子JEOL)；實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)儀：型號(hào)PIKORed 96(美國ThermoFisher儀器有限公司)；萊卡組織處理機(jī)：EM TP，(德國萊卡)；玻璃制刀機(jī)：EM KMR3(德國萊卡)。

1.2方法

1.2.1分組與造模小鼠30只隨機(jī)分為陰性對照組、近視模型組、中藥干預(yù)組，每組10只。陰性對照組雙眼不做任何處理，剩余兩組使用半透明眼罩遮蓋右眼使其形成FDM模型，左眼不做任何處理。

1.2.2治療方法陰性對照組與近視模型組灌胃生理鹽水0.15mL/d，中藥干預(yù)組灌胃駐景丸加減方混懸液0.546g/(kg·d)(0.15mL/d)，連續(xù)灌胃4wk。

1.2.3屈光度與眼軸長度檢測分別于實(shí)驗(yàn)開始時(shí)、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測量所有小鼠右眼屈光度、眼軸長度。所有小鼠使用托吡卡胺散瞳，共4次，每次間隔5min，4次后間隔20min，散瞳完成后由1名有經(jīng)驗(yàn)的驗(yàn)光師使用帶狀檢影鏡，對小鼠右眼驗(yàn)光,每只小鼠驗(yàn)光3次，取平均值。固定小鼠后，使用鹽酸丙美卡因滴其右眼結(jié)膜囊，后使用眼部A超測量小鼠右眼眼軸長度，測量5次，取其平均值。

1.2.4免疫熒光法定位和檢測Iba1 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組隨機(jī)選3只小鼠使用過量麻醉[10%水合氯醛溶液(350mg/kg)]處死小鼠，在手術(shù)顯微鏡下完整摘除所選小鼠右眼眼球，并將其放入4%多聚甲醛固定液中固定2h，梯度乙醇、二甲苯脫水，浸蠟包埋，制備視網(wǎng)膜切片；將脫蠟后的切片浸入0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)，微波爐中高火加熱至沸騰后斷電，間隔5min后，反復(fù)1次，冷卻，分別加入濃度1∶100 Iba1一抗，4℃下過夜后水沖洗3次；加入二抗，按常規(guī)步驟進(jìn)行，通過熒光掃描顯微鏡攝像系統(tǒng)對切片進(jìn)行圖像采集，每張切片先低倍鏡下觀察后，分別選取3個(gè)視野采集400倍顯微圖像。

1.2.5透射電鏡實(shí)驗(yàn)4wk時(shí)，小鼠右眼視網(wǎng)膜取材與固定方法同“1.2.4”項(xiàng)，各組選用1只小鼠右眼視網(wǎng)膜，通過丙酮逐級(jí)脫水，滲透與包埋，制成超薄切片(50nm)，經(jīng)醋酸鈾和鉛鹽染色后使用JEM-1400FLASH透射電鏡觀察、進(jìn)行圖像采集。

1.2.6WesternBlot檢測視網(wǎng)膜組織LC3Ⅱ和p62表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組取3只小鼠右眼視網(wǎng)膜搖勻吸出上清液并測蛋白水平，分別放入β-actin(內(nèi)參蛋白)、LC3Ⅱ、p62一抗，濃度分別對應(yīng)1∶100000、1∶1000、1∶5000，常規(guī)孵育過夜，PVDF膜洗3次，放入濃度1∶5000二抗，重復(fù)沖洗，顯色凝膠成像系統(tǒng)掃描觀察，最后使用天能GIS機(jī)箱控制軟件V2.0對條帶進(jìn)行曝光掃描，目標(biāo)蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值比值為相應(yīng)蛋白表達(dá)結(jié)果。

1.2.7q-PCR檢測視網(wǎng)膜組織LC3Ⅱ和p62mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組取3只小鼠右眼視網(wǎng)膜，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用q-PCR技術(shù)檢測LC3Ⅱ、p62 mRNA表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參基因。使用Primer Premier引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)篩選各基因特異性引物。所有引物均交由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，見表1。采用2-ΔΔCt法對各組小鼠眼球中的LC3Ⅱ、p62 mRNA相對表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

表1 本次檢測所用引物及堿基序列

2 結(jié)果

2.1屈光度與眼軸長度屈光度變化見表2，圖1A，眼軸長度變化見表3，圖1B。實(shí)驗(yàn)開始，三組小鼠屈光度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)屈光度結(jié)果示，與陰性對照組比較，中藥干預(yù)組、近視模型組屈光度降低(均P<0.01)，近視模型組、中藥干預(yù)組造模眼形成相對近視。實(shí)驗(yàn)開始，3組小鼠眼軸長度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)眼軸長度結(jié)果示，近視模型組、中藥干預(yù)組眼軸長度較陰性對照組眼軸長度顯著增加(均P<0.01)，且近視模型組眼軸長度較中藥干預(yù)組眼軸長度有增加趨勢。

圖1 各組小鼠檢測指標(biāo)匯總 A：小鼠屈光度；B：小鼠眼軸長度；C：免疫熒光法檢測視網(wǎng)膜組織中Iba1平均熒光強(qiáng)度；D：Western Blot法檢測視網(wǎng)膜組織中LC3Ⅱ及p62蛋白相對表達(dá)水平；E：q-PCR法測定視網(wǎng)膜組織中LC3Ⅱ、p62 mRNA相對表達(dá)水平；F：LC3Ⅱ、p62、β-actin蛋白條帶。aP<0.05,bP<0.01 vs 陰性對照組；cP<0.05 vs 近視模型組。

表2 各組小鼠屈光度的變化

表3 各組小鼠眼軸長度的變化

2.2免疫熒光法定位和檢測Iba1結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)Iba1標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞觀察到：陰性對照組少量靜息狀態(tài)Iba1陽性表達(dá)位于視網(wǎng)膜外叢狀層與內(nèi)叢狀層，近視模型組、中藥干預(yù)組主要位于外叢狀層、內(nèi)叢狀層與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，近視模型組、中藥干預(yù)組Iba1向神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層遷移，見圖2。Iba1通過平均光密度計(jì)算，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)結(jié)果示，近視模型組Iba1蛋白含量(29.6087±0.4998)表達(dá)最強(qiáng)，陰性對照組(25.2637±2.7394)次之，中藥干預(yù)組(24.4810±1.8684)最少，三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.107，P=0.036)；與陰性對照組比較，近視模型組Iba1蛋白含量增加(P<0.05)；與近視模型組比較，中藥干預(yù)組Iba1蛋白含量降低(P<0.05)，見圖1C。

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜免疫熒光定位Iba1結(jié)果 A：陰性對照組；B：近視模型組；C：中藥干預(yù)組。Iba1為紅色點(diǎn)狀染色。GCL:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；INP：內(nèi)叢狀層；INL:內(nèi)核層；ONP：外叢狀層；ONL：外核層。

2.3透射電鏡觀察各組小鼠自噬形態(tài)學(xué)表征透射電鏡觀察見圖3，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)陰性對照組小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)未見明顯病變；近視模型組視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)見少量自噬小體，但線粒體等細(xì)胞器無明顯異常；中藥干預(yù)組小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)較正常，見少量自噬小體，且細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整。

圖3 透射電鏡觀察各組小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) A：陰性對照組；B：近視模型組；C：中藥干預(yù)組。細(xì)胞核(N)、線粒體(Mi)、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)、色素顆粒(↑)、自噬的色素細(xì)胞(↑)。

2.4WesternBlot法檢測視網(wǎng)膜組織中LC3Ⅱ及p62表達(dá)LC3Ⅱ、p62蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與近視模型組比較，中藥干預(yù)組LC3Ⅱ及p62表達(dá)具有明顯增加趨勢，陰性對照組有遞減趨勢(P>0.05，圖1D，表4)，蛋白條帶見圖1F。

表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組小鼠視網(wǎng)膜組織中LC3Ⅱ、p62蛋白表達(dá)

2.5q-PCR檢測視網(wǎng)膜組織LC3Ⅱ及p62mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)q-PCR結(jié)果見圖1E，表5。與陰性對照組相比，近視模型組小鼠眼球視網(wǎng)膜組織中LC3Ⅱ mRNA表達(dá)升高(P<0.05)；與近視模型組相比，中藥干預(yù)組小鼠眼球視網(wǎng)膜組織中LC3Ⅱ mRNA表達(dá)升高(P<0.05)。與陰性對照組相比，近視模型組小鼠眼球視網(wǎng)膜組織中p62 mRNA具有升高趨勢(P>0.05)；與近視模型組相比，中藥干預(yù)組小鼠眼球視網(wǎng)膜組織中p62 mRNA有升高趨勢(P>0.05)。

表5 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組小鼠視網(wǎng)膜組織中LC3Ⅱ、p62 mRNA的表達(dá)

3 討論

近年來，近視發(fā)病率呈爆發(fā)性增長，將給患者、社會(huì)帶來極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[15]，雖然近視的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為近視發(fā)生發(fā)展受環(huán)境、遺傳以及種族因素共同影響[16]。近視的發(fā)展與炎癥因子、腫瘤壞死因子、ROS累積密切相關(guān)，近視持續(xù)發(fā)展將造成視網(wǎng)膜退變，例如視網(wǎng)膜色素上皮層功能障礙、視網(wǎng)膜厚度、氧供、血管、微循環(huán)及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層等異常[17-19]，將增加近視患者視力障礙及失明的風(fēng)險(xiǎn)[20]。因此應(yīng)積極尋找有效干預(yù)近視所致視網(wǎng)膜退變的方法。

由于FDM小鼠被廣泛用于近視研究中[21]，本研究采用遮蓋3周齡C57BL/6J小鼠右眼的方法制成FDM動(dòng)物模型。小鼠視力發(fā)育呈生理化遠(yuǎn)視發(fā)展[22]，因此我們用測量結(jié)果“相對近視化”即屈光度降低來評(píng)判近視造模是否成功。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)與陰性對照組比較，近視模型組、中藥干預(yù)組屈光度降低(P<0.01)，向近視方向漂移，形成相對近視，與李欣蒙等[23]FDM造模結(jié)果一致，表明近視造模成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)與陰性對照組比較，近視模型組及中藥干預(yù)組眼軸長度顯著增加，與本課題組前期實(shí)驗(yàn)通過使用半透明眼罩遮蓋小鼠右眼，誘導(dǎo)小鼠眼軸增加、視網(wǎng)膜厚度改變結(jié)果相一致[24]，結(jié)合屈光度向近視方向漂移，表明軸性近視造模成功。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，近視發(fā)展過程中，通過調(diào)節(jié)自噬，可延緩近視進(jìn)一步發(fā)展[13]，然而其具體機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)壓力刺激下，可通過啟動(dòng)自噬以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、適應(yīng)不利環(huán)境[25]。近視視網(wǎng)膜疾病中，自噬具有促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞的存活與死亡的雙重作用：正常水平的自噬可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞在有害壓力環(huán)境下防御能力增加，自噬過多可能會(huì)誘導(dǎo)視網(wǎng)膜受損[26]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為免疫細(xì)胞，正常機(jī)制下可調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。Lennikov等[27]發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞受到炎癥因子、腫瘤壞死因子等刺激時(shí)可促進(jìn)其活化、遷移，并導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變。另外研究指出視網(wǎng)膜缺氧時(shí)，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管生成與血管病變[28]，加速視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡[29]。Dang等[30]發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)自噬，可有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化引起的炎癥反應(yīng)與氧化反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)干預(yù)藥物使用源于駐景丸加減方制成的我院院內(nèi)制劑補(bǔ)精益視片，前期研究發(fā)現(xiàn)該方可恢復(fù)感光細(xì)胞自噬，抑制感光細(xì)胞凋亡，促進(jìn)視網(wǎng)膜的修復(fù)等作用[31]。方中含有枸杞子、菟絲子、楮實(shí)子、五味子、茺蔚子、三七等，全方配伍起到“肝腎同補(bǔ)、活血明目”的作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)菟絲子[32]、枸杞子[33]、五味子[34]、楮實(shí)子[35]具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用；三七[36]可以減少細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)自噬，具有抗凋亡作用、改善缺血灌注的作用。綜上所述，駐景丸加減方具有調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜自噬、抗炎抗氧化、改善微循環(huán)的功能。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)與陰性對照組比較，近視模型組Iba1表達(dá)顯著增加并向神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層遷移(P<0.05)，表明近視形成過程中,近視模型組小膠質(zhì)細(xì)胞活化并發(fā)生遷移。近視的發(fā)生發(fā)展與炎癥、ROS積累過多相關(guān)[2]，而炎癥因子與ROS積累過多將導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化[37]，研究發(fā)現(xiàn)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞將再次釋放炎癥細(xì)胞因子及ROS,進(jìn)一步加重光感受器細(xì)胞受損[38]。光感受器細(xì)胞受損，具有增加小鼠視網(wǎng)膜病變的風(fēng)險(xiǎn)[39]。研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞具有吞噬脫落光感受器細(xì)胞外節(jié)盤膜、防止受損光感受器細(xì)胞的作用，在維持光感受器正常功能方面具有重要意義[40]，故本實(shí)驗(yàn)通過透射電鏡觀察小鼠視網(wǎng)膜色素上皮層細(xì)胞自噬情況。q-PCR結(jié)果示，與陰性對照組比較，近視模型組LC3Ⅱ mRNA顯著增加(P<0.05)，p62 mRNA、LC3Ⅱ與p62蛋白表達(dá)有增加趨勢，結(jié)合透射電鏡結(jié)果，表明近視模型組自噬激活。研究表明增強(qiáng)自噬可抑制炎癥反應(yīng)與氧化反應(yīng)[41]，故推測近視模型組自噬的發(fā)生可能與抑制近視發(fā)展過程中出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)、氧化反應(yīng)相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與近視模型組比較，中藥干預(yù)組LC3ⅡmRNA相對表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，p62 mRNA、LC3Ⅱ與p62蛋白表達(dá)有增加趨勢，結(jié)合透射電鏡結(jié)果，表明中藥干預(yù)組視網(wǎng)膜自噬增強(qiáng)；此外中藥干預(yù)組屈光度向近視漂移相對減少(P<0.05)，Iba1表達(dá)顯著降低(P<0.05)，提示駐景丸加減方對抑制相對近視發(fā)展、小膠質(zhì)細(xì)胞活化均有一定的干預(yù)作用。小膠質(zhì)細(xì)胞活化可造成視網(wǎng)膜新生血管生成與血管病變[27]，研究發(fā)現(xiàn)三七[42]、枸杞[43]、五味子[44]可通過促進(jìn)自噬并抑制細(xì)胞凋亡改善機(jī)體缺血，故推測中藥干預(yù)組干預(yù)近視發(fā)展的同時(shí)，通過抗炎抗氧化、改善微循環(huán)等抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，并起到增強(qiáng)視網(wǎng)膜自噬的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)駐景丸加減方可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化,增強(qiáng)視網(wǎng)膜自噬以達(dá)到干預(yù)近視進(jìn)一步發(fā)展和保護(hù)視網(wǎng)膜的目的，為駐景丸加減方在近視干預(yù)中提供理論依據(jù)。