胞葬作用調控巨噬細胞極化影響高鐵環境下眼表炎癥發生

鄭景怡，孟 霞，王 智，夏金丹，謝安琪，費志剛，肖啟國

0 引言

眼表慢性炎癥是干眼、特應性角結膜炎、瘢痕性類天皰瘡、Stevens-Johnson綜合征和眼表化學傷等諸多非感染性眼表疾病的共同病理特征及核心發病機制。長期眼表慢性炎癥不僅破壞角膜的屏障功能，促進眼表上皮細胞凋亡，進而發展為角膜上皮結膜化、眼表新生血管或鱗狀上皮化生，同時也是導致眼部刺激癥狀并造成視功能障礙的主要原因，因此闡明這類疾病的炎癥發生機制及調控因素具有重要的臨床意義。

胞葬作用是指吞噬細胞(主要是巨噬細胞)吞噬并清除凋亡細胞的過程。巨噬細胞作為體內細胞因子的主要來源，成功清除凋亡細胞可以減弱炎癥因子的表達，誘導巨噬細胞向抑制炎癥反應的M2型極化[1]。鐵代謝異常將導致組織多種病變的發生[2-3]，本課題組前期研究發現眼表鐵過載可能加重眼表炎癥及組織損傷，本研究通過腹腔注射右旋糖酐鐵建立高鐵小鼠模型，繼而分別使用XMD8-92抑制和辛伐他汀增強巨噬細胞胞葬作用，探討高鐵環境下眼表炎癥的發生機制，明確胞葬作用是否通過調控巨噬細胞極化參與眼表炎癥發生。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物選取50只6～8周齡健康C57BL/6雄性小鼠，體質量20±2g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，均在裂隙燈下排除眼表疾病。所有實驗小鼠均飼養于南華大學動物實驗中心。本研究通過南華大學醫學倫理委員會批準。

1.1.2主要儀器及試劑裂隙燈(卡爾蔡司有限公司)，右旋糖酐鐵(上海麥克林生化科技有限公司)，XMD8-92原粉、辛伐他汀原粉(Apexbio公司)，CD86、CD206、生長停滯特異性基因6(growth arrest specific gene 6， Gas6)、Mer酪氨酸激酶(Mer tyrosine kinase，MerTK)多克隆抗體(Abcam公司)，逆轉錄試劑盒(北京康為世紀)，IgG抗體-HRP多聚體、β-actin(Proteintech公司)，白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9，MMP-9)ELISA試劑盒(Proteintech公司)。

1.2方法

1.2.1動物模型建立及分組采用隨機數字表法將實驗動物分為5組，每組10只。正常對照組，腹腔注射生理鹽水0.2mL，每3d注藥1次；單純鐵劑組，腹腔注射50mg/mL右旋糖酐鐵0.2mL，每3d注藥1次；抑制劑組，腹腔注射50mg/mL右旋糖酐鐵0.2mL，每3d注藥1次，第14d起每天增加1次腹腔注射50mg/kg XMD8-92(注射前0.5h將XMD8-92按小鼠體質量比例溶于50% DMSO)0.2mL；增強劑組，腹腔注射50mg/mL右旋糖酐鐵0.2mL，每3d注藥1次，第14d起每天增加1次腹腔注射10mg/kg辛伐他汀(注射前0.5h將辛伐他汀按小鼠體質量比例溶于50% DMSO)0.2mL；溶劑對照組，腹腔注射50mg/mL右旋糖酐鐵0.2mL，每3d注藥1次，第14d起每天增加1次腹腔注射50% DMSO溶劑0.2mL。

1.2.2各組小鼠相關觀察及檢測指標分別于注藥后第7、14、28d同一時間點(7p.m.)在裂隙燈下觀察各組小鼠眼前節情況并對右眼進行拍照，并參照文獻方法進行眼表炎癥指數評估[4]及角膜熒光素染色評分[5]；注藥28d后，所有實驗小鼠處死后在顯微鏡下迅速摘取右側完整眼球(帶結膜及眶周皮膚)和淚腺組織，0.9%生理鹽水沖洗去除眼球壁血跡及毛發，各組分別選取3只小鼠的右側完整眼球和淚腺組織迅速置于4%多聚甲醛溶液中，4℃保存，用于HE染色及免疫熒光染色等相關檢測；各組其余完整眼球在顯微鏡下進行角膜、結膜分離，與淚腺組織分別置于對應EP管，-80℃保存，用于RT-PCR、Western blot、ELISA等相關檢測。

1.2.3HE染色及免疫熒光染色將完整眼球及淚腺組織固定、包埋、切片。常規HE染色，封片后顯微鏡下觀察。免疫熒光染色滴加稀釋比例為1∶50的CD86、CD206多克隆抗體過夜孵育，洗滌復溫后滴加熒光標記二抗孵育，復染封片后熒光顯微鏡下觀察(其中綠色為陽性信號，藍色為DAPI核染信號)。

1.2.4RT-PCR檢測采用Trizol試劑分別提取各組小鼠角膜、結膜及淚腺組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，加入正向和反向引物以及SYBR后，實時定量PCR進行擴增。誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase， iNOS)正向引物序列5’-GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA-3’，反向引物序列5’-GTGGACGGGTCGATGTCAC-3’；精氨酸酶-1 (arginase-1，Arg-1)正向引物序列5’-CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG-3’，反向引物序列5’-AGGAGCTGTCATTAGGGACATC-3’；內參照β-actin正向引物序列5’-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3’，反向引物序列5’-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’。通過QuantStudioTM 7系統對數據進行分析處理，定量檢測采用比較閾值循環(Ct)方法，β-actin作為內參照，用相對定量方法(2-ΔΔCt)計算目的基因mRNA的相對表達量。

1.2.5Westernblot免疫印跡分析將各組小鼠角膜、結膜及淚腺組織中加入裂解液提取蛋白，制膠，取200μL蛋白，與50μL 5×Loading buffer混勻，根據蛋白定量的結果加樣，第一孔marker 2.5μL，其它每孔10μL，電泳，分別切膠Gas6(69kD)、MerTK(160kD)、β-actin(42kD)后轉膜，經封閉后加入適當稀釋的兔抗Gas6、MerTK(1∶1000)和鼠抗β-actin(1∶5000)過夜孵育，洗膜后加入羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體(1∶6000)或羊抗鼠IgG抗體-HRP多聚體(1∶5000)孵育，ECL顯影，結果以目的蛋白與參照蛋白條帶比值表示各種目的蛋白的相對表達量。

1.2.6ELISA檢測將各組小鼠角膜、結膜及淚腺組織研碎后離心取上清提取蛋白，按照ELISA試劑盒步驟，酶標儀檢測各組小鼠組織中IL-1β、TNF-α、MMP-9的表達水平。加生物素標記抗體工作液(稀釋比例為1∶100)，加辣根過氧化物酶標記親和素工作液(稀釋比例為1∶100)，然后每孔加入底物溶液，37℃避光顯色，用酶標儀在450nm波長處依序對各孔光密度(OD值)進行檢測。以OD值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標，繪制標準曲線，計算樣本濃度。

2 結果

2.1眼表情況及眼表炎癥指數評估正常對照組小鼠全程角膜透明，結膜未見明顯充血。注射右旋糖酐鐵后小鼠眼表炎癥反應持續加重，注藥后第7、14d，單純鐵劑組、抑制劑組、增強劑組、溶劑對照組組間差異均無統計學意義(P>0.05)；注藥后第28d，與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組眼表炎癥反應加重明顯(P<0.05)，而增強劑組眼表炎癥反應減輕(P<0.05)，見表1。

表1 各組注藥后不同時間點眼表炎癥指數評分 分)

2.2角膜熒光素染色正常對照組小鼠全程角膜透明，角膜熒光素染色均無染色斑點。注射右旋糖酐鐵后小鼠角膜熒光素染色評分持續上升，注藥后第7、14d，單純鐵劑組、抑制劑組、增強劑組、溶劑對照組組間差異均無統計學意義(P>0.05)；注藥后第28d，與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組角膜上皮屏障功能破壞明顯加重(P<0.05)，而增強劑組角膜上皮屏障功能修復(P<0.05)，見表2。

表2 各組注藥后不同時間點角膜熒光素染色評分 分)

2.3眼表組織病理學變化注藥28d后，正常對照組小鼠角膜上皮光滑，各層結構完整清晰且染色均勻；結膜上皮光滑連續，可見散在分布的杯狀細胞；淚腺各小葉及腺泡間細胞排列緊密，腺泡結構完整，大小均一。與正常對照組比較，單純鐵劑組和溶劑對照組小鼠角膜上皮層細胞數量略增加，細胞排列相對雜亂，且少量扁平細胞缺失脫落，上皮欠光滑；結膜上皮完整性欠佳，細胞排列雜亂，杯狀細胞減少；淚腺各小葉及腺泡細胞排列相對雜亂，結構欠清晰，腺泡大小欠均一。與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組小鼠角膜上皮層細胞數量增多，排列雜亂不規則，扁平細胞脫落明顯；結膜上皮細胞數量增多，排列雜亂，上皮欠光滑，且杯狀細胞明顯減少甚至消失；淚腺各小葉及腺泡間細胞明顯排列雜亂不規則，結構明顯紊亂，且腺泡大小不均一。增強劑組小鼠在角膜結構完整性和細胞形態方面明顯改善，細胞排列較為規則，相應損傷有所減輕；結膜中杯狀細胞增加，上皮完整性稍改善；淚腺腺泡結構形態方面明顯改善，腺泡大小較為均勻。除正常對照組外，其他各組小鼠結膜及淚腺中均可見片狀的褐色鐵沉積，見圖1。

圖1 注藥28d后HE染色觀察小鼠各眼表組織的病理學變化。

2.4眼表組織中巨噬細胞極化情況

2.4.1CD86在眼表組織中的表達注藥28d后對小鼠角膜、結膜及淚腺組織進行CD86蛋白免疫熒光染色。正常對照組各組織中較少有CD86表達。與正常對照組比較，單純鐵劑組和溶劑對照組各組織中免疫熒光染色均增強，即CD86蛋白表達增強。與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組各組織中CD86蛋白的免疫熒光染色強度進一步增強，而增強劑組各組織中CD86蛋白表達均下調，見圖2。

圖2 注藥28d后免疫熒光染色檢測小鼠各眼表組織中CD86表達情況。

2.4.2CD206在眼表組織中的表達注藥28d后對小鼠角膜、結膜及淚腺組織進行CD206蛋白免疫熒光染色。正常對照組小鼠各組織中均可見CD206蛋白表達。與正常對照組比較，單純鐵劑組和溶劑對照組各組織中CD206的免疫熒光染色強度減弱，即CD206蛋白表達下調。與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組免疫熒光染色強度進一步減弱，即CD206蛋白表達水平進一步下調，而增強劑組各組織中CD206蛋白免疫熒光染色增強，CD206蛋白的表達相對增強，見圖3。

圖3 注藥28d后免疫熒光染色檢測小鼠各眼表組織中CD206表達情況。

2.4.3iNOS在眼表組織中的表達注藥28d后采用RT-PCR檢測小鼠角膜、結膜及淚腺組織中iNOS mRNA的表達情況。與正常對照組比較，單純鐵劑組和溶劑對照組各組織中iNOS mRNA的表達均明顯增加(P<0.05)。與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組各組織中iNOS mRNA的表達均增強(P<0.05)，而增強劑組各組織中iNOS mRNA的表達均受到抑制(P<0.05)，見表3。

表3 注藥28d后小鼠各眼表組織中iNOS mRNA的表達情況

2.4.4Arg-1在眼表組織中的表達注藥28d后采用RT-PCR檢測小鼠角膜、結膜及淚腺組織中Arg-1 mRNA的表達情況。與正常對照組比較，單純鐵劑組和溶劑對照組各組織中Arg-1 mRNA的表達均明顯下調(P<0.05)。與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組各組織中Arg-1 mRNA的表達均受到抑制(P<0.05)，而增強劑組各組織中Arg-1 mRNA的表達均上調(P<0.05)，見表4。

表4 注藥28d后小鼠各眼表組織中Arg-1 mRNA的表達情況

2.5眼表組織中胞葬作用情況注藥28d后采用Western blot檢測小鼠角膜、結膜及淚腺組織中Gas6、MerTK蛋白表達情況。與溶劑對照組比較，抑制劑組各組織中Gas6、MerTK蛋白表達均明顯下調(P<0.05)，而增強劑組各組織中Gas6、MerTK蛋白表達均明顯上調(P<0.05)，見圖4，表5。

表5 注藥28d后小鼠各眼表組織中胞葬作用相關蛋白的表達情況

圖4 注藥28d后Western blot檢測小鼠各眼表組織中Gas6和MerTK蛋白表達情況 A：角膜；B：結膜；C：淚腺。

2.6眼表組織中炎癥因子的表達注藥28d后采用ELISA檢測小鼠角膜、結膜及淚腺組織中IL-1β、TNF-α、MMP-9等炎癥因子的表達情況。與正常對照組比較，單純鐵劑組和溶劑對照組各組織中IL-1β、TNF-α、MMP-9等炎癥因子的表達均明顯上調(P<0.05)。與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組各組織中IL-1β、TNF-α、MMP-9等炎癥因子的表達情況均明顯上調(P<0.05)，而增強劑組各組織中IL-1β、TNF-α、MMP-9等炎癥因子的表達均明顯下調(P<0.05)，見表6～8。

表6 注藥28d后小鼠各眼表組織中IL-1β蛋白的表達情況

表7 注藥28d后小鼠各眼表組織中TNF-α蛋白的表達情況

表8 注藥28d后小鼠各眼表組織中MMP-9蛋白的表達情況

3 討論

巨噬細胞在組織器官發育、人體內穩態的維持、組織修復與再生中均發揮重要作用[6]。受不同的微環境影響，巨噬細胞主要極化為促進炎癥反應發生的M1型[7]和抑制炎癥反應并促進損傷修復的M2型[8]，在功能上相互拮抗。CD86、iNOS與CD206、Arg-1分別作為M1型與M2型巨噬細胞從精氨酸代謝途徑[9]、細胞膜蛋白的表達[10]等方面的鑒別指標。低鐵環境是保持巨噬細胞自然防御的關鍵，巨噬細胞內鐵的含量可以影響其極化類型[11]。淚液乳鐵蛋白含量下降是干眼重要的病理生理特征之一。本課題組前期研究發現淚液乳鐵蛋白含量下降可導致眼表鐵過載，進而加重眼表炎癥及組織損傷，提示高鐵環境可以加重眼表炎癥反應。本研究給小鼠腹腔注射高劑量右旋糖酐鐵，對眼表情況進行動態觀察，發現單純鐵劑組與正常對照組小鼠比較眼表炎癥反應加重，眼表組織中M1型巨噬細胞表達占優勢且炎癥因子的表達增強，說明腹腔注射過量鐵劑可使機體鐵代謝失衡，誘導巨噬細胞向M1型極化，促進眼表炎癥發生。

胞葬作用在維持機體正常生長發育、內穩態及促進炎癥消退等方面有重要作用。細胞外信號調節激酶5 (extracellular signal regulated kinase 5，ERK5)作為絲裂原活化蛋白激酶家族的重要組成部分，在調控細胞反應過程中起著重要作用，可被不同因素作用而介導細胞發生相應變化，參與細胞增殖、分化、遷移、衰老和凋亡等多種病理表8注藥28d后小鼠各眼表組織中MMP-9蛋白的表達情況

生理過程[12]。Heo等[13]在對巨噬細胞胞葬作用抑制動脈粥樣硬化機制的研究中發現，ERK5的失活可通過下調胞葬作用相關信號因子如Gas6、MerTK等的表達抑制胞葬作用，并提出他汀類藥物能顯著激活巨噬細胞中ERK5及其相關信號分子，并上調胞葬作用相關信號因子的表達，增強胞葬作用。而XMD8-92作為ERK5的抑制劑可下調胞葬作用相關信號因子的表達，使巨噬細胞胞葬作用功能受損[14]。

研究表明，胞葬作用影響炎癥發生和消退，并誘導巨噬細胞表型和功能改變[15]。巨噬細胞吞噬功能受損可產生更高水平的促炎癥細胞因子，而巨噬細胞成功清除凋亡細胞可以減弱炎癥因子的表達，促進抗炎介質白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)或轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等釋放，誘導M2型極化[1]。眼表上皮細胞過度凋亡不僅是眼表炎癥發病機制之一，也是眼表炎癥重要特征之一[16]，巨噬細胞通過胞葬作用持續不斷地吞噬凋亡細胞對維持眼表損傷與修復平衡、促進眼表炎癥反應消退具有重要的積極意義。本研究通過觀察注藥后28d小鼠眼表情況發現，與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，抑制劑組眼表炎癥反應進一步加重，眼表組織中M1型巨噬細胞表達進一步上調，同時炎癥因子的表達相應增強，說明XMD8-92作為胞葬作用的抑制劑通過調控巨噬細胞向M1型極化促進眼表炎癥發生，加重眼表組織損傷；而與單純鐵劑組和溶劑對照組比較，增強劑組眼表炎癥反應減輕，眼表組織中M2型巨噬細胞表達占優勢，同時炎癥因子的表達出現下調，說明辛伐他汀作為胞葬作用增強劑通過調控巨噬細胞向M2型極化減輕眼表炎癥反應，促進眼表組織損傷修復。

綜上所述，本研究發現腹腔注射右旋糖酐鐵可成功誘導巨噬細胞向M1型極化，而XMD8-92作為胞葬作用的抑制劑可進一步誘導巨噬細胞向M1型極化促進眼表炎癥反應、加重眼表組織損傷，辛伐他汀作為胞葬作用的增強劑可誘導巨噬細胞向M2型極化減輕眼表炎癥反應從而有效地改善組織損傷，說明胞葬作用可通過調控巨噬細胞極化影響眼表炎癥反應發生。本研究不僅證實了高鐵環境可以加重眼表炎癥反應，而且為闡明眼表炎癥發生機制提供了新的依據。