常染色體STR基因座母源突變的觀察分析與親權指數計算

蘭菲菲 梁杰 胡聽聽 陳延冰 杜麗 張彥 尹愛華

短串聯重復序列(short tandem repeat, STR)是人類重要的遺傳學標記，由2～6個堿基組成核心序列，其串聯重復次數不同形成長度不等的等位基因，構成個體差異和遺傳多態性[1]。STR基因座具有分布廣泛、多個基因座聯合應用有較高非父排除率及多態性高等特點[2]。由于其遵循孟德爾遺傳規律且檢測方便快捷，目前STR基因座的檢測分析廣泛應用于親子鑒定或個體識別的科學研究及鑒定實踐中。鑒定的實際檢測應用中發現STR基因座發生突變的情況較常見，且不同STR基因座的突變率有所不同[3]。有研究比較了國內不同地區人群的突變率，發現個別STR基因座在不同人群中的突變率也存在一定差異[4-5]。在STR基因座的突變情況中，父源突變較常見，母源突變發生率相對較低，文獻報道的父源突變與母源突變比例平均約為3∶1[6-8]。由于母源性突變對鑒定結論及親權指數計算的影響較復雜，在鑒定實踐時應多予以關注。本文采用PowerPlex?21試劑盒檢測20個常染色體STR基因座，觀察分析10 271例親子鑒定案例中STR基因座母源突變現象和特點，探討母源突變基因座親權指數計算方法，為法醫物證的鑒定實踐提供參考，豐富廣東省漢族人群STR基因座的母源突變數據。

資料與方法

一、資料

血液、頭發、羊水樣本來源于廣東省婦幼保健院醫學遺傳中心司法鑒定所日常受理檢測的10 271例用于司法用途與個人了解的親子鑒定案例，被檢測對象為廣東省漢族人群，簽署知情同意書后采集受檢者外周血或頭發樣本，羊水樣本由醫學遺傳中心產前診斷醫生采集。

二、 實驗方法

1.DNA提取：實驗血液與羊水樣本應用Chelex-100法提取基因組DNA。滅菌的1.5 mL的離心管中加入1 mL滅菌純凈水，每個樣本加入混合均勻的2 μL全血(羊水樣本則在1.5 mL離心管中直接加入1 000 μL吹打混合均勻的羊水混懸液)，在震蕩儀上劇烈震蕩30 s后室溫放置30 min。低溫離心機中12 000 rpm離心3 min，丟棄上清液收集沉淀細胞。每個樣本管中加入200 μL 5%的Chelex-100混懸溶液(頭發樣本將毛囊部位剪下浸泡于Chelex-100混懸溶液中)，劇烈震蕩15 s后瞬時離心，放入恒溫水浴箱中56℃孵育30 min后，移至100℃水浴中煮沸8 min，震蕩完畢放入低溫離心機中13 000 rpm離心3 min，吸取上清DNA約100 μL于新的1.5 mL滅菌離心管中保存于-20℃冰箱備用。

2.PCR復合擴增20個STR基因座的等位基因：采用Powerplex?21擴增試劑盒(美國Promega公司)，按照操作說明書在一個PCR反應管內進行20個常染色體(D1S1656、D2S1338、D3S1358等)和1個性染色體(Amelogenin)STR基因座多重等位基因位點的PCR復合擴增。擴增體系為Master Mix 5 μL；Primer Pair Mix 5 μL；DNA模板1 μL；超純水14 μL。擴增條件為96℃ 1 min；(94℃ 10 s—59℃ 1 min—72℃ 30 s)30 cycles; 60℃ 10 min。

3.STR基因座的等位基因分型：對擴增后的PCR產物進行毛細管電泳，配制反應體系為PCR擴增產物1 μL；甲酰胺9 μL ；Powerplex?21試劑盒內標0.5 μL。充分混合均勻后，95℃變性3 min，立即放在冰上冷卻3 min，用3500XL基因分析儀(美國AB公司)完成毛細管電泳。按照Powerplex?21試劑盒的操作說明，利用GeneMapper?ID-X軟件(美國AB公司)，根據說明書給出的軟件參數設置，分析毛細管電泳數據，以Powerplex?21試劑盒中的等位基因分型標準物(Allelic Ladder)作為分析參照，得到每個樣本21個STR基因座的等位基因分型。

4. 統計學處理：分析母親與孩子是否存在親子關系，對于確定親子關系的案件(累積親權指數大于10 000)，孩子STR基因座的等位基因在母親STR基因座的等位基因中找不到來源的，不符合孟德爾遺傳定律時，則發生了母源突變，突變步數為STR基因座的核心重復序列增加或者減少的單位數量。統計發生突變基因座的數量及比例、突變步數、突變等位基因片段大小及其所占比例。

結 果

一、STR基因座母源突變情況分析

在Powerplex?21體系的20個STR常染色體基因座中，18個基因座發生了母源突變，D21S11發生突變的比例最高，占總突變數量的17.4%，其次是D12S391(15.1%)與PentaE(11.6%)，其他15個基因座突變數量小于10例(表1)，基因座的突變比例有所不同。

表1 18個母源性突變STR基因座的突變率與突變比例Table 1 Mutation rate and mutation ratio of 18 maternal mutant STR loci

如表2所示，在觀察到的86例突變中，大部分均為一步突變95.4%，兩步突變和三步突變各有2例，占比2.3%。在突變基因座的等位基因中，核心重復序列增加的有44例(51.2%)，減少的為28例(32.6%)，未能明確的有14例(16.3%)。其中兩步突變增加與減少2個重復序列各有1例，三步突變的2例均為增加3個重復序列。在86例母源突變的STR基因座中，發生在短等位基因的2例(2.3%)，中等位基因的75例(87.2%)，長等位基因9例(10.5%)(表2)。

二、增加STR基因座檢測對STR基因座母源突變親權指數的影響

如表3所見，本文中觀察到的一步突變均無需增加STR基因座檢測，包括計算的突變STR基因座親權指數在內，即可達到結果判讀要求(累積親權指數大于10 000為支持親子關系；累積親權指數小于10 000為排除親子關系)[9]，其累積親權指數范圍為104～1011。兩步突變及三步突變對STR基因座親權指數數值影響較大，需增加STR基因座檢測數量以得到正確鑒定結果與結論。

表4中STR基因座突變案件中，包含突變STR基因座在內的Powerplex?21體系20個常染色體STR基因座的累積親權指數未大于10 000，無法達到鑒定結果判讀條件，采用STR-typer10G(珠海科登生物工程有限公司)或MicroreaderTM23sp ID體系(蘇州閱微基因技術有限公司)增加STR基因座的擴增檢測，經過計算增加檢測后兩個體系的全部STR基因座累積親權指數，均能夠得出支持親子關系的鑒定結論。

表2 STR基因座母源突變的特點Table 2 Maternal mutation characteristics of STR loci

表3 54例母源性基因座突變情況及親權指數計算Table 3 Mutation of maternal loci and paternity index calculation in 54 cases

表3(續)

表4 增加STR基因座檢測后鑒定結論明確的案件分析Table 4 Cases analysis of precise conclusion by adding STR loci detection

表4(續)

三、突變基因座的親權指數計算

根據《親權鑒定技術規范》[9]的要求，突變的STR基因座應參與計算累積親權指數，因此，發生母源突變的STR基因座應按照不同情形分別計算其親權指數，具體情形及計算公式可參見圖1。

圖1 母源突變STR基因座的親權指數計算Figure 1 Paternity index calculation of maternal mutant STR loci

討 論

STR基因座的突變在法醫物證鑒定實踐中較常見，國內外均有關于不同STR基因座的突變報道[10]。STR基因座的突變以逐步突變模式為主，目前普遍認為其發生機制是由于DNA在復制過程中發生滑動或者錯配而導致STR基因座重復單位數目的變化，主要表現為增加或者減少一個重復單位的一步突變，約占突變現象的90%[11]。重復單位數目多的基因座片段長度相對較大，觀察到的突變現象較多[12]。由于精子與卵細胞在分化過程中的細胞分裂次數不同，STR基因座突變中也存在突變來源的性別差異，精細胞發生的DNA復制多，發生滑動或者錯配的幾率相對較大，來自父親的父源性突變發生率較母源性突變高[13]。中國不同地區人群STR基因座等位基因頻率具有一定差異，因此，不同地區人群STR基因座突變率也有所不同，研究發現河南省漢族人群的Penta E、D6S1043及D12S391等基因座突變率與北方地區、廣東省、云南省人群有顯著性差異[14-15]。而在STR基因座突變相關的研究中，常染色體STR基因座母源性突變特點的分析及親權指數計算鮮有報道。

PowerPlex?21體系是親子鑒定案件應用較廣泛的檢測試劑盒，包括20個常染色體STR位點和1個性染色體位點，目前對該試劑盒STR基因座母源性突變的專題報道較少見。本機構自2013年開始在鑒定實踐檢案中應用PowerPlex?21試劑盒，在本文中觀察了10 271例親子鑒定案例突變情況，發現了86例STR基因座的突變來源于母親，突變率在0.003%～0.05%之間。其中82例為一步突變，兩步突變與三步突變各2例。

一、STR基因座突變的真實性分析在應對母源性STR突變位點的作用

STR基因座突變的本質是不符合孟德爾遺傳規律的現象，是在鑒定案件存在親子關系的考慮下，個別出現不符合遺傳規律的STR基因座。因此，真實發生的STR基因座突變與所用的檢測試劑盒無相關性，不同試劑盒檢測到的突變STR基因座等位基因分型應相同，遇到STR基因座突變時條件允許可利用不同檢測體系進行確認。同時觀察分析突變STR基因座的峰高和峰面積，排除STR基因座發生了等位基因丟失現象[16]。

二、突變STR基因座的親權指數計算在應對母源性STR突變位點的作用

親子鑒定的父權指數計算是基于母親為生物學母親的前提，母親如果存在不符合孟德爾遺傳規律的STR基因座等位基因，考慮可能存在以下兩種情況。

1.母親是生物學母親，不符合遺傳規律的STR基因座為母源性突變，可根據三聯體親子鑒定或二聯體親子鑒定進行計算，具體為：(1)父母子三聯體的親子鑒定，要求鑒定是否為生物學父親時，母親STR基因座突變可以考慮先分析母親與孩子的親子關系，確定為生物學母親后，根據《親權鑒定技術規范》[9]中三聯體不符合遺傳規律的親權指數計算方法計算突變STR基因座的父權指數。(2)只有母親與孩子參與的二聯體親子鑒定，突變基因座的親權指數按照《親權鑒定技術規范》[9]中二聯體不符合孟德爾遺傳規律情形時的公式計算，分為幾種情況(以發生一步突變為前提)，即①母親與孩子均為雜合子，PI=μm/(8Pb) ；例如表3中D2S1338基因座，母親等位基因分型為20, 25，孩子為18, 19，PI=μ/(8P19)。②母親為純合子，孩子為雜合子或者母親為雜合孩子為純合，PI=μm/(4Pb)；例如表3中D5S818基因座，母親分型為9, 12，孩子分型為13，PI=μ/(4P13)。③母親與孩子均為純合子或母親是雜合孩子是純合且有兩種等位基因突變可能性，PI=μm/(2Pb)；例如表4中TPOX基因座母親分型為9，孩子分型為9，PI=μ/(2P9)。④母親與孩子均為雜合子，兩個等位基因均發生了突變，PI=μm(Pa+Pb) /(8PaPb)；例如表4中FGA基因座，母親分型為22, 24.2，孩子分型為21,23.2，PI=μ(P21+P23.2)/(8P21P23.2)。⑤母親為純合子，孩子為雜合子，且有兩種等位基因突變可能性，PI=μm(Pa+Pb) /(4PaPb)。⑥母親與孩子均為雜合子，但其中一個等位基因有兩種突變可能性，另一個等位基因有一種突變可能性，PI=μm(2Pa+Pb) /(8PaPb)。例如表4中D8S1179基因座，母親分型為15,17，孩子分型為14,16，PI=μ(2P14+P16)/(8P14P16)。Pa與Pb分別為孩子突變STR基因座等位基因a或b的頻率，μm為女性突變率，可取值0.0005[9]。

2.母親不是生物學母親，該情況可出現一個或多個STR基因座不符合遺傳規律。以下情形可能會導致該種情況的發生，例如委托人隱瞞真實情況，孩子是母親的近親；母親或孩子是嵌合體，體內存在至少2種不同細胞系，外周血液基因型與身體其他器官基因型不相同，異源嵌合體案例及相關研究報道也是法醫學的研究熱點[17]。三聯體的親子鑒定案例，如果確定不是生物學母親，可按照雙親皆疑的方法計算父權指數[18]。二聯體親子鑒定案例可根據《親權鑒定技術規范》[9]中二聯體不符合孟德爾遺傳規律情形時的公式計算親權指數。當委托人隱瞞真實的情況下，鑒定結果可能會出現與肯定親子關系突變相類似的結果，即只有個別基因座出現不符合遺傳規律現象，容易將實際是排除的基因座位點按照突變的方式處理，導致錯誤的鑒定結論，可考慮加做STR基因座檢測位點以排除近親血緣關系的干擾，防止親子鑒定結果的誤判，得出正確的鑒定結論。

STR基因座母源性突變相對于父源突變具有發生率低、分析計算較復雜、易導致結果誤判等特點，本文在PowerPlex?21體系中觀察到廣東省人群發生的86例母源突變，涉及18個STR基因座，95.4%為一步突變，發生在中等位基因的突變較多(87.2%)，核心重復序列的增加導致的突變占多數51.2%。文中詳細分析了發生在不同情形時的母源突變STR基因座的親權指數計算，為應對親子鑒定中母源突變STR基因座的鑒定案例提供參考，為豐富廣東省漢族人群母源STR突變數據庫提供遺傳信息支持。