VEGFA基因多態性與小于胎齡兒的易感性

劉慧 邵珊珊 黃錕 嚴雙琴 劉雨薇 朱鵬 郝加虎 陶芳標

小于胎齡兒(small for gestational age,SGA)是指出生體重低于同胎齡出生體重第10百分位數或2個標準差的活產兒，發生率約為8%～13%[1]。與適于胎齡兒(appropriate for gestational age infant,AGA)相比，SGA的圍產期患病率和死亡率較高，兒童期發生營養不良、認知行為異常以及成年后罹患高血壓、糖尿病等心腦血管和代謝性疾病的風險增加[2]。血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)是胎盤血管生長發育的關鍵調節因子，可促進血管內皮細胞增殖、遷移及活化[3-4]，已有研究證實SGA胎盤VEGFA表達降低[5]。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)對基因表達和功能可產生著重要影響，VEGFA基因變異或可通過改變VEGFA基因表達或VEGFA分泌影響胎盤血管生成導致SGA的發生。然而，目前相關研究較為少見。本研究采用巢式病例-對照研究設計探討了VEGFA基因多態性與SGA易感性的關聯。

對象與方法

1.研究對象：研究對象均來自馬鞍山優生優育隊列，該隊列納入了于2013年5月到2014年9月在馬鞍山婦幼保健院建冊并計劃在該院分娩的孕婦共3 474例。在隊列的單胎活產中共篩選出318例分娩SGA且無妊娠并發癥(高血壓或糖尿病)的母親，按照1:1.5隨機選取477例分娩AGA且無妊娠并發癥的母親作為AGA組，但僅有183例SGA母親和298例AGA母親提供了靜脈血樣本。因此，本研究共納入481例孕婦，其中SGA組183例，AGA組298例。本項目已通過安徽醫科大學生物醫學倫理委員會審查(批號：20170283)。所有研究對象均簽署知情同意書。

2.診斷標準：SGA為出生體重低于同胎齡嬰兒平均體重的第10百分位的嬰兒，AGA為出生體重位于同胎齡嬰兒平均體重的第10百分位至第90百分位的嬰兒[6]。

3.問卷調查：包括母親年齡、文化程度、吸煙、飲酒、家庭月收入、母親孕前體重指數(body mass index,BMI)和父親BMI等。

4. SNP的選擇及基因分型：使用QIAamp DNA Investigator試劑盒提取靜脈血DNA。基于NCBI官方網站采用以下步驟篩選VEGFA基因上的潛在功能性SNP位點。首先，篩選位于3′UTR、5′UTR或編碼區的錯義突變、移碼突變；然后，選擇其中在中國漢族人群中的最小等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)≥ 0.1的位點；最后，進行連鎖不平衡檢驗，保留高度連鎖(r2≥0.8)位點中的一個進行研究。最終納入7個SNPs(rs2010963、rs833061、rs10434、rs1570360、rs3025020、rs3025040、rs3025053)。使用上海天昊生物科技有限公司的imLDRTM多重SNP分型試劑盒進行基因分型，ABI3730XL分析儀進行測序，GeneMapper 4.1軟件(Applied Biosystems,USA)分析基因型。為保證基因分型的準確性，對5%的樣本實施雙盲檢測。

結果

1.研究對象一般情況：如表1所示，兩組研究對象在母親年齡、文化程度、吸煙、飲酒、家庭月收入和父親BMI的分布差異均無統計學意義。但是SGA組母親孕前BMI顯著低于AGA組，差異有統計學意義。

表1 481例研究對象的基本特征

2.VEGFA基因多態性與SGA易感性的關聯分析：除VEGFArs3025053外，其余位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，納入后續分析。如表2所示，rs2010963位點的CC、GC和GG基因型在SGA組和AGA組的分布差異具有統計學意義。其他位點在兩組之間的基因型分布差異無統計學意義。調整母親年齡、文化程度、吸煙、飲酒、家庭月收入后，與攜帶rs2010963 CC基因型孕婦相比，攜帶GC基因型的孕婦分娩SGA的風險顯著增加(共顯性模型：OR=1.94，95%CI=1.12～3.35)；攜帶GC/GG基因型的孕婦分娩SGA的風險也顯著增加(顯性模型：OR=1.69，95%CI=1.01～2.83)。敏感性分析進一步校正母親孕前BMI和父親BMI后，結果仍有顯著性(顯性模型：OR=1.75，95%CI=1.03～2.98)。但是，經FDR校正后rs2010963變異與SGA易感性關聯的顯著性消失(P=0.222)。基于1000 Genome database(https://www.internationalgenome.org/)公共數據庫查詢到rs2010963位點在中國漢族人群中的MAF為0.440。隨后根據Power 3.0計算[7]，對于rs2010963位點在中國漢族人群中的MAF為0.440，在α=0.05 的檢驗水平下，SGA發病率為10%時，本研究的樣本量有78%把握度能檢驗出OR=1.7的關聯性。未發現其他5個SNP位點與SGA發生風險之間有顯著關聯性。

討論

VEGFA基因位于染色體6p21.3，其編碼蛋白是一種強有力的血管內皮生成因子,可影響血管通透性，調節早期胎盤血管的發育[3]。本研究結果提示，孕婦攜帶VEGFArs2010963 G等位基因可能會增加分娩SGA的風險。之前有一項基于澳大利亞和新西蘭人群的研究探討了VEGFArs699947和rs3025039與SGA關聯性，沒有發現其與SGA相關[5]。本研究在中國漢族人群中也沒有發現與VEGFArs3025039高度連鎖的rs3025040與SGA顯著相關。

目前雖然沒有發現VEGFArs2010963與SGA易感性的報道，但國內外關于VEGFArs2010963與低出生體重和子癇前期的研究已較多。BanyaszI等[8]在128例低出生體重兒和200例健康足月兒中開展的巢式病例對照研究，結果顯示VEGFArs2010963 C等位基因增加了嬰兒低出生體重的發生風險。這與本研究發現G等位基因會增加SGA的發生風險是相反的。VEGFArs2010963多態性對子癇前期的影響在不同研究間也存在不一致性。在中國[9]和匈牙利[10]人群中，攜帶rs2010963 G等位基因的母親對子癇前期的易感性降低，但在菲律賓[11]和突尼斯[12]人群中發現該等位基因與子癇前期無顯著關聯。遺傳背景的種族差異可能是導致不同研究結果的重要因素。rs2010963的G等位基因在中國人群、歐洲人群和美國人群的頻率分別為0.596、0.720和0.628。此外，環境因素沒有被充分考慮和控制也可能是各研究結果不一致的原因。

表2 VEGFA位點多態性與SGA易感性的多因素Logistic回歸模型分析

本研究采用巢氏病例對照研究設計探討了母親VEGFA遺傳變異與SGA易感性的關系，結果提示攜帶G等位基因的孕婦分娩SGA的風險增加。但存在以下局限性。首先，經過FDR校正后，rs2010963變異對SGA的發生風險的影響無顯著性，雖然在本研究的樣本量之下，有78%的把握度檢驗出rs2010963變異與SGA易感性的關聯性，但是對于MAF較小的位點，本研究的樣本量所能達到的把握度有限，需要更大的樣本再次驗證。其次，本研究缺乏rs2010963致VEGFA表達下調或功能損害的直接證據。VEGFA遺傳變異與SGA易感性的研究有待進一步的深入探討。