胎盤嵌合對無創產前篩查假陽性影響

張麗春 王杰 郭志遠 馬科 黃艷 白海棟 劉愛菊 賈躍旗

無創產前篩查(non-invasive prenatal screening，NIPS) 是一種應用高通量測序等分子遺傳學技術，檢測孕期母體血漿中胎兒游離DNA片段，以評估胎兒常見染色體非整倍體風險的產前篩查技術，主要目標疾病為21-三體綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征[1]。同時NIPS也可檢出其他染色體非整倍體(rare autosomal trisomies，RATs)、性染色體非整倍體(sex chromosome aneuploidies，SCAs)及致病性拷貝數變異(copy number variation，CNV)。相對于傳統的血清學篩查有更高的準確性和更低的假陽性率。據統計NIPS對三種目標疾病的檢測準確率分別達99.4%、97.4%和92.5%，假陽性率分別為0.2%、0.5%和0.8%[2]。引起NIPS假陽性的原因主要包括母體嵌合體、母體腫瘤及雙胎之一消亡或限制性胎盤嵌合體(confined placental mosaicism，CPM)[3]。

隨著NIPS的廣泛應用，CPM導致的假陽性越來越受到研究者的關注。CPM指異常細胞系幾乎只存在于胎盤，而未見于羊膜細胞或其他胎兒組織中，即染色體嵌合異常只發生在胎盤而胎兒染色體正常的現象[4-5]。產生CPM的主要原因是外周血中的游離DNA主要來源于胎盤絨毛滋養層細胞而不是胎兒本身，不能完全代表胎兒的真實情況，造成胎盤和胎兒核型的差異。研究表明CPM可能會改變胎盤功能，導致胎兒宮內發育受限、妊娠丟失或圍產兒死亡等[6]。

本研究收集了因NIPS高風險在本院進行產前診斷，引產或產后的35例胎盤組織，借助于熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis，CMA)或基因組拷貝數變異測序(copy number variation sequencing，CNV-seq)技術對胎盤多個位置進行遺傳學檢測，并對假陽性病例進行跟蹤隨訪，評估胎盤嵌合對NIPS假陽性及妊娠結局的影響。

對象與方法

1. 對象：2018年—2020年NIPS檢測結果高風險、在本院行介入性產前診斷、引產或生產后追蹤到胎盤組織的樣本35例。取得受檢者知情同意情況下，對胎盤多個位置行FISH、CMA或CNV-Seq檢測。本研究經內蒙古自治區婦幼保健院倫理委員會審查批準(No.2019-007-2)。

2. 胎盤采集方法：選擇自然流產或正常分娩的胎盤，以臍帶為中心點，分別在胎盤母面、胎兒面的中心和邊緣各取1份組織，在近胎盤端采集1份臍帶組織，每份約黃豆大小(長：0.5～1.0 cm，寬：0.5～1.0 cm，深：0.2～0.3 cm)，共采集5份組織標本，做好相應位點標記；對于未收集到完整胎盤的樣本，多點采樣混合后進行檢測。NIPS提示13、16、18、21及22-三體高風險樣本行FISH檢測，其他異常選擇CMA或CNV-Seq檢測。

3.檢測方法：

(1)染色體核型分析。在超聲引導下無菌抽取15～20 mL羊水，離心后接種于常規培養基，收獲細胞、制片、G顯染。鏡下計數25個分裂相，每個標本分析5個核型，如發現嵌合體，則計算50個分裂相，參照人類細胞基因組學國際命名體系(ISCN 2020)[7]描述核型。

(2)染色體微陣列分析(CMA)。使用核酸提取試劑盒(美國，Promega 公司)對羊水和組織樣本進行全基因組DNA提取，將提取的DNA樣本用CytoScanTM750K微陣列芯片系統(美國，Affymetrix公司)進行檢測，操作步驟包括酶切、連接、PCR擴增、純化、片段化、標記、雜交洗滌、掃描和分析等，使用ChAS 4.0軟件對結果進行分析。參考美國醫學遺傳學與基因組學學會的建議[8]評判CNV的臨床意義，參照人類細胞基因組學國際命名體系(ISCN 2020)[7]描述芯片結果。

(3)熒光原位雜交檢測(FISH)。將預處理好的樣品固定于載玻片，并經SSC溶液洗滌和胃酶處理將核酸暴露。將載玻片和探針分別在變性劑中變性，載玻片變性后經預冷的乙醇溶液固定、干燥、預熱；變性后的探針滴于載玻片雜交區，加蓋蓋玻片，封膠，在封閉的濕盒中過夜雜交。雜交后的載玻片置于變性液中洗滌，再用70%乙醇溶液固定。將洗滌后的載玻片經DAPI復染劑染色，在熒光顯微鏡下鏡檢。鏡下進行細胞計數并進行結果判讀。每個雜交區至少計數50個信號強度且無重疊的雜交細胞。如大于90%的細胞顯示非整倍體信號，則判定為非整倍體；如10%～60%的細胞顯示非整倍體信號，則可能為嵌合體；如信號差無法確定則加大細胞計數至100個，參照人類細胞基因組學國際命名體系(ISCN 2020)[7]描述FISH結果。

(4)基因組拷貝數變異測序(CNV-seq)。樣本送檢至深圳華大臨床檢驗中心進行實驗分析。將50 ng基因組DNA進行片段化處理，獲得平均大小為300 bp的DNA片段，構建測序文庫，使用BGI-SEQ500基因測序儀(中國，華大基因)進行高通量全基因組測序，應用BWA軟件將測序所得序列與GRCh37/hg19基因組進行比對分析，保留唯一定位的Reads；統計校正后1Mb區域的Reads個數，并與正常參考數據庫進行比較。參考美國醫學遺傳學與基因組學學會的建議[8]進行變異解讀，將拷貝數變異分為五類，即致病(總分≥0.99)、疑似致病(0.90≤總分≤0.98)、臨床意義未明(-0.89≤總分≤0.89)、疑似良性(-0.98≤總分≤-0.90)和良性(總分≤-0.99)。

4.妊娠結局隨訪與統計：隨訪NIPS假陽性病例妊娠結局及胎兒發育情況，用于后續評估胎盤嵌合對NIPS假陽性及妊娠結局的影響，NIPS、產前診斷和胎盤檢測結果的一致率為兩種方法檢測結果一致的例數分別在總例數中的占比。

結果

1. NIPS、產前診斷、胎盤檢測結果比較分析：35例NIPS高風險的孕婦，NIPS結果與產前診斷結果及胎盤檢測結果進行比較分析(見表1)。35例NIPS高風險病例中,NIPS與產前診斷結果一致25例，一致率為71.4%(25/35)；10例不一致，為NIPS假陽性；NIPS與胎盤檢測結果一致29例，一致率為82.9%(29/35)；6例不一致，其中2例NIPS提示CNVs，其NIPS結果與胎盤檢測結果異常位置不同。產前診斷結果與胎盤檢測結果一致例數為30例，一致率為85.7%(30/35)。

35例NIPS高風險樣本中，常見的T21、T18、T13高風險有26例，其產前診斷與NIPS結果的一致率為84.6%(22/26)，胎盤檢測結果與NIPS結果的一致率為92.3%(24/26)。

2. 10例NIPS假陽性病例胎盤檢測及妊娠結局隨訪結果：經檢測發現6例存在CPM(見表2)，CPM占比60%(6/10)。隨訪妊娠結局及胎兒發育狀況發現其中5例孕婦正常妊娠，且胎兒發育正常，NIPS結果分別為T21、T13、X單體高風險各1例及2例CNVs。其中，T21、T13、X單體高風險病例，產前診斷結果均正常，胎盤檢測結果顯示NIPS與胎盤異常類型一致。其余2例為CNVs，NIPS結果分別為dup(2q12.2-q13，5.25M)-M和del(20p12.3-q12.1，9.01M)，產前診斷結果均正常，胎盤檢測結果1例為dup(7p14.1p14.1)127.90 kb及dup(Xp22.2p22.2)399.37 kb，另一例為del(7q22.1q22.1)120.57 kb。1例CPM病例引產，NIPS結果為T6高風險，產前診斷結果為16號染色體存在部分缺失arr[GRCh37]16p13.11(14892975_16528123)×1，胎盤檢測結果為6號三體嵌合與16p13.11部分缺失，同時產前超聲顯示胎兒宮內生長受限，引產。

假陽性中的4例NIPS結果分別為T21、T18、T4和X單體高風險，胎盤結果均正常，產前診斷結果3例正常，1例(T4高風險)由于孕期羊水少，未進行產前診斷，產后回訪孕婦自述胎兒正常。NIPS提示T4高風險病例Z值為12.822，孕期胎兒發育正常，孕婦36周正常妊娠，胎兒發育正常，該病例在產后發現孕婦自身患有胰腺尾部腫瘤。NIPS提示X單體高風險病例Z值為12.869，產前診斷明確為假陽性，后對母親外周血核型檢測發現母親為45，X[10%]/46，XN[90%]嵌合體。其余2例NIPS提示T21高風險和T18高風險病例Z值分別為-3.611和3.156，產前診斷及胎盤檢測結果均正常。

表1 35例NIPS高風險病例產前診斷及胎盤結果統計

表2 6例胎盤嵌合病例臨床資料及胎盤結果

討論

NIPS自2011年應用于臨床以來，在產前篩查領域得到了廣泛應用和認可[9]。但是由于NIPS檢測的胎兒游離DNA主要來源于細胞滋養層中胎盤細胞的凋亡，可能會導致NIPS結果與胎兒的真實情況不一致，造成檢測結果的假陽性[10]或假陰性[11]。

在造成NIPS假陽性的原因中，胎盤嵌合是重要因素之一[12]。NIPS檢測的胎兒游離DNA絕大部分來源于胎盤滋養層細胞，胎盤滋養層細胞與胎兒都是由同一個合子發育而來，合子形成后，一部分細胞發育成胎盤的細胞系，一部分細胞發育成胎兒的細胞系，通常情況下，兩者的遺傳物質相同。Wang等[13]分析了NIPS高風險孕婦進行產前診斷的結果，發現二者中13-三體的符合率為44%，18-三體的符合率為64%，21-三體的符合率為93%，提示胎兒與胎盤的遺傳物質可能并非完全相同。本研究統計了NIPS高風險病例分別與產前診斷和胎盤結果的一致率，發現NIPS與胎盤的一致率為82.9%(29/35)，與產前診斷的一致率為71.4%(25/35)，雖然胎兒與胎盤染色體并非完全相同，但是一致率較高(85.7%)，NIPS對常見染色體非整倍體的檢測效果仍具有重要的參考意義。同時，NIPS結果與產前診斷結果存在的偏差提示NIPS出現高風險結果時，建議進行產前診斷的進一步驗證，以排除假陽性和其他染色體異常的存在。

2017年Hartwig等[14]回顧性分析了206例NIPS結果與胎兒核型不一致病例，發現假陽性病例182例(88%)，其中60例(33%)分析了假陽性的生物學或技術原因，發現19例(32%)是由CPM導致的，認為CPM是導致假陽性的主要因素之一。本研究的10例NIPS假陽性病例中6例為CPM，CPM占比60%(6/10)，說明CPM是造成NIPS假陽性的主要原因。研究發現CPM與宮內發育遲緩、自然流產、宮內死亡、死產及胎盤功能異常有關，可能會導致產前和圍產期不良妊娠結局[15]。Grati等[16]回顧性分析了124例CPM和468例的正常對照人群，認為只有16-三體會增加CPM的不良妊娠結局。吳小青等[17]最新研究的5例CPM中，3例(60%)胎兒因生長受限伴或不伴其他超聲異常而被終止妊娠，胎兒生長受限的發生率明顯高于之前報道，認為CPM與不良妊娠結局有相關性的觀點。本研究6例CPM中，隨訪5例妊娠結局正常，胎兒發育正常，未出現胎兒生長受限；1例胎兒超聲異常提示胎兒宮內發育遲緩，其NIPS為T6高風險，羊水核型及胎盤檢測均存在16號染色體異常，引產，支持CPM與不良妊娠結局有相關性的觀點。因此，對NIPS高風險的人群建議進行產前診斷同時密切監測胎兒發育情況。

本研究中對4例NIPS提示性染色體異常的樣本經產前診斷后，2例評估為NIPS假陽性的樣本，產后收集到胎盤檢測，發現其中1例為胎盤嵌合，1例為母體性染色體嵌合。提示母親性染色體異常也可能是導致NIPS假陽性的原因。因此，對于NIPS性染色體異常的孕婦建議檢測母親的染色體核型，以排除母親染色體異常對胎兒正常核型的影響。除此之外，母體罹患腫瘤是導致NIPS假陽性的另一個原因。本研究發現1例孕期NIPS提示T4高風險病例，未進行產前診斷，胎盤檢測結果正常，跟蹤隨訪，孕婦自述胎兒發育正常，但在產后發現孕婦存在胰腺尾部腫瘤，進行了腫瘤切除，推測母親孕期罹患腫瘤可能導致NIPS假陽性。

同時，本研究還發現2例NIPS假陽性，分別為T21高風險和T18高風險，通過胎盤檢測未找到假陽性原因，但兩例高風險Z值均偏低，分別為-3.611和3.156，推測可能是由于胎盤嵌合程度較低或取樣位置受限。

綜上所述，胎盤嵌合是影響NIPS假陽性的重要原因之一，除此之外，母體染色體異常和母體罹患腫瘤都會導致NIPS假陽性。盡管NIPS的準確性高于傳統的血清學篩查，但由于受胎盤嵌合及母體等多種因素的影響，NIPS的準確率不能達到100%，無法取代介入性產前診斷。因此，建議選擇NIPS的孕婦均應進行檢測前和檢測后遺傳咨詢，包括關于假陽性風險提示；在進行任何不可逆的手術之前，應進行產前診斷來確認或排除胎盤嵌合對胎兒的影響。由于病例數較少，本研究也存在一定的局限性，為了更全面的揭示NIPS假陽性的原因，還有待于收集更多的病例及臨床數據，為CPM及非CPM病例的臨床咨詢提供更充分的依據。