黑素瘤小鼠脾臟淋巴細胞抗腫瘤效應及機制的初步探究

鄒銳濤 蔡桂月 陳曉旋 肖 鏗 樊志金 陳嶸祎

1廣東醫科大學，廣東廣州， 523024；2南方醫科大學皮膚病醫院，廣東廣州，510091

惡性黑素瘤(malignant melanoma，MM)是起源于黑素細胞的一種惡性腫瘤，具有侵襲性強，如不及時治療預后差等特點[1]。在現階段，MM常規治療的療效不佳，其中手術僅對早期治療有效。近年來，免疫治療在MM中發揮著越來越重要的角色。目前，應用在MM中的免疫治療主要有：免疫檢查點抑制劑(PD-1和CTLA-4等單克隆抗體)；細胞因子(IL-2，IFN-α-2b等)；溶瘤病毒(溶瘤病毒T-VEC)；腫瘤疫苗(肽疫苗、DC疫苗等)；過繼性細胞療法(腫瘤浸潤淋巴細胞療法、工程T細胞受體治療、嵌合抗原受體T細胞療法、NK細胞療法等)[2]。其中，過繼性細胞療法是近幾年來在腫瘤免疫治療中的一大熱點。

過繼性細胞療法(adoptive cell therapy，ACT)是通過收集患者體內的免疫細胞，經過體外激活或基因修飾，擴增至足夠數量時并選擇具有腫瘤靶向的免疫細胞，再回輸到機體從而起到抗腫瘤的一種新型的免疫治療方法[3,4]。這些免疫細胞可來源患者外周血淋巴細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes, TIL)或淋巴因子激活的殺傷細胞(Lymphokine activated killer cell, LAK)。嵌合抗原受體T細胞免疫療法(CAR-T)是對外周血中淋巴細胞進行磁珠分選T細胞后再進行基因編輯成CAR-T，對于腫瘤治療具有精準、快速、高效，但對于實體瘤的治療效果欠佳，在MM治療中的研究較少；TIL是從腫瘤組織中提取出來的，這類淋巴細胞具有精準識別腫瘤細胞的能力，能夠有效地殺傷腫瘤細胞，對于轉移性黑素瘤具有較好的治療效果[5-7]。但是TILs量少，分離困難，很多情況下是功能耗竭的，無法發揮正常的抗腫瘤作用，發展新的淋巴細胞來源具有重要意義。

本研究通過構建黑素瘤小鼠模型，提取荷瘤小鼠脾臟淋巴細胞，與黑素瘤細胞共培養，發現與正常脾臟淋巴細胞相比，來自黑素瘤小鼠的脾臟淋巴細胞具有更明顯的抑瘤現象，通過對兩組淋巴細胞進行活化刺激，也發現黑素瘤小鼠來源的脾臟淋巴細胞分泌更高的腫瘤殺傷因子。脾臟淋巴細胞易獲取、數量多，這一研究發現或許為MM的過繼性細胞療法提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系和實驗動物 黑素瘤細胞系B16購自上海蓋寧生物科技有限公司，雌性C57BL/6小鼠，SPF級，購自廣東省醫學實驗動物中心；在南方醫科大學動物倫理委員會指導下進行。

1.1.2 實驗試劑 北美胎牛血清、1640培養基、0.25% Trypsin-EDTA (1X)0.25% Trypsin-EDTA (1X)胰酶(美國Gibco公司)；PD-1、Granzyme B、perforin、GAPDH一抗、β-actin一抗(美國Cell Signaling Technology公司)；Cyanine5-抗小鼠CD3、FITC-抗小鼠CD8、PE-抗小鼠CD4、PE-cy7抗小鼠Granzyme B、PE-抗小鼠perforin單克隆熒光抗體(美國Biolegend公司)； CCK8試劑盒(同仁化學/DOJINDO)；Calcein/PI 細胞活性與細胞毒性檢測試劑盒、山羊抗兔二抗、BCA蛋白濃度測定試劑盒、紅細胞裂解液(上海碧云天生物技術有限公司);刀豆蛋白A、Hass緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)；TNF-α、IFN-γ ELISA試劑盒(北京達科為生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 小鼠黑素瘤細胞系B16，加入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的1640培養基，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養，長至70%～80%時，使用胰酶消化后傳代以及液氮凍存保種。

1.2.2 荷瘤小鼠模型構建 B16細胞長至70%～80%時，胰酶消化后加入2 mL培養基重懸，離心5 min，去除上清，PBS清洗后用1 mL PBS重懸，計數，細胞量稀釋至106/150 μL，小鼠背部備皮，每只每個部位注射150 μL，觀察3周。

1.2.3 小鼠脾臟淋巴細胞提取 荷瘤小鼠建模3周后，腫瘤長至7～8 mm時，將正常小鼠與荷瘤小鼠進行解剖，取其脾臟剪碎置于Hass緩沖液中進行研磨，70 μm細胞篩過濾，使用淋巴細胞分離液進行提取，加入2 mL紅細胞裂解液裂解5 min，離心并用PBS清洗后，使用1 mL完全培養基重懸，計數、備用。

1.2.4 Western blot 用刀豆蛋白A(ConA)5 μg/mL對淋巴細胞進行刺激，即將脾臟淋巴細胞分四組：正常小鼠脾臟淋巴細胞(NL)、腫瘤小鼠脾臟淋巴細胞(ML)、NL+ConA、ML+ConA，每組細胞數為2×106，鋪板刺激24 h，收集細胞，每組用200 μL RIPA裂解液冰上裂解30 min，離心收集上清進行BCA蛋白定量，加1/4的5×loading buffer混勻后100℃金屬浴10 min，每組取20 ug蛋白進行10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉進行封閉1 h，TBST漂洗三遍，分別與PD-1、Granzyme B、perforin、GAPDH、β-actin等蛋白一抗(1∶1000)于4℃敷育過夜，TBST漂洗三遍后，加入二抗(1∶5000)室溫敷育1h，TBST漂洗三遍后進行ECL 化學發光劑顯色，Image J分析軟件計算各組細胞目的蛋白的相對表達量。

1.2.5 ELISA 對上述分組細胞鋪板刺激后離心收集上清，進行TNF-α、IFN-γ ELISA測定。嚴格按照說明進行檢測，檢測完成后，10 min內進行酶標儀測量每孔在450 nm發射波長下的吸光度值，標準曲線R2控制在0.998以上，根據標準曲線計算出TNF-α、IFN-γ表達水平。

1.2.6 Calcein/PI熒光染色 收集B16細胞進行24孔板鋪板，每孔10萬個細胞，4 h細胞貼壁后分3個組，每組3個復孔，即陰性對照組、正常組(NL組)、荷瘤組(ML組)，按照1∶20(B16細胞：NL/ML)加入淋巴細胞，37℃、5% CO2培養箱中共培養24 h，去上清，PBS漂洗2遍，加入Calcein AM/PI染色液(1∶500)，每孔200 uL，37℃、5% CO2培養箱避光孵育30 min，熒光顯微鏡觀察。

1.2.7 CCK8 收集B16細胞進行96孔鋪板，每孔10000個細胞，4 h細胞貼壁后共分為7個組、每組6個復孔。即空白組(無細胞)、陰性對照組、ConA 組、NL組、ML組、NL+ConA組、ML+ConA組，按照1∶20(B16細胞：NL/ML)加入淋巴細胞，ConA 5 μg/mL刺激24 h，每孔加入10 μL CCK8溶液后，37℃、5% CO2培養箱中孵育2 h,進行酶標儀測量每孔在450 nm發射波長下的吸光度值。

1.2.8 流式細胞術 取提前備好的NL/ML各106，分別用100 μL 1×的結合緩沖液重懸，每管分別加入5 μL的Cyanine5-抗小鼠CD3、FITC-抗小鼠CD8、PE-抗小鼠CD4流式抗體，4℃避光孵育20 min；而ConA刺激24 h后的NL/ML，分別用100 μL 1×的結合緩沖液重懸，每管分別加入5 μL的Cyanine5-抗小鼠CD3、FITC-抗小鼠CD8，4℃避光孵育20 min，漂洗后對細胞進行破膜，分別加5 μL PE-cy7抗小鼠Granzyme B、PE-抗小鼠perforin流式抗體，4℃避光孵育20 min，每管再加1mL緩沖液漂洗，離心后用500 μL 1×的結合緩沖液重懸，用流式細胞儀檢測。

1.3 統計學方法 本研究使用Image J和GraphPad Prism 8.0進行制圖以及實驗數據的統計分析，兩樣本間采用配對樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05，P<0.05，表示差異具有統計學意義。所有實驗結果均重復3遍以上。

2 結果

2.1 B16細胞分別與NL/ML共孵育24 h后各組B16細胞的增殖能力以及Calcein AM/PI熒光染色后的結果 NL和ML按照20∶1，分別與B16細胞共孵育24 h后，ML組與陰性對照組以及NL組相比較，B16細胞增殖能力均顯著下降，差異具有統計學意義(*t=39.07，*P<0.05；#t=9.39，#P<0.05，圖1a); Calcein AM/PI熒光染色后的結果也與之對應，并且NL與ML都依附在B16細胞表面(圖1b)。

*P<0.05：與陰性對照組比較，# P<0.05：與正常組比較

2.2 B16細胞分別與NL/ML共孵育并加入ConA刺激24 h后各組B16細胞的增殖能力 B16 細胞按比例1∶20與NL/ML共孵育并加入ConA(5 μg/mL)刺激24h后，ConA組細胞增殖能力相對于陰性對照組無差異，排除ConA對于B16細胞的影響；ML組與陰性對照組以及NL組相比較，B16細胞增殖能力均顯著下降(*t=69.61，*P<0.05；#t=5.44，#P<0.05，圖2)。

2.3 NL組和ML組脾臟淋巴細胞中CD8+、CD4+T細胞比例占比 流式分析發現，在免疫T細胞表達CD3陽性條件下， NL組,中CD8+和CD4+T細胞比例分別為：25.1%、59.9%；在ML組中CD8+和CD4+T細胞比例分別為：31.3%、58.9%。ML組中CD8+T細胞明顯高于NL組中CD8+T細胞，差異具有統計學意義(t=11.56，P<0.05，圖3)。

圖2 CCK-8法檢測細胞增殖能力 *P<0.05：與陰性對照組比較，# P<0.05：與正常組+刀豆蛋白A比較 圖3 流式細胞術分析NL和ML中CD8+與CD4+比例占比 *** P<0.001

2.4 NL組和ML組PD-1蛋白表達水平 與正常小鼠脾臟淋巴細胞NL組相比，B16荷瘤小鼠脾臟淋巴細胞ML組中PD-1蛋白表達水平顯著下調; 在ConA(5 μg/mL)刺激活化24 h后， ML組PD-1蛋白表達水平依舊較NL組顯著下調(圖4)。

圖4 Western blot檢測NL、ML、NL +ConA和ML+ConA中 PD-1蛋白表達水平

2.5 在ConA刺激24 h之后，NL組和ML組淋巴細胞顆粒酶B、穿孔素蛋白表達水平以及TNF-α、IFN-γ細胞因子表達水平。

在ConA(5 ug/mL)刺激活化24 h后，ML組中顆粒酶B、穿孔素蛋白表達水平較NL組顯著上調(圖5a)；TNF-α、IFN-γ細胞因子的表達水平都較NL組都顯著上升(t1=22.72，P1<0.05；t2=11.56，P2<0.05，圖5b)；ML組中CD8+T細胞的顆粒酶B表達比例相對NL組更高，ML組(17.8%)較NL組(14.3%)提高了24.5%；而穿孔素的表達比例，ML組(11.3%)較NL組(8.78%)提高了28.7%，(圖5c、5d)，而未經ConA刺激的淋巴細胞幾乎不表達顆粒酶B以及TNF-α、IFN-γ細胞因子。

****P<0.0001；***P<0.001

3 討論

MM極易發生侵襲且早期即可發生轉移，常規治療的療效不理想，但MM是對免疫治療相對敏感的惡性腫瘤，近幾年免疫治療在MM中的應用已經取得重大發展。免疫檢查點抑制，特別是抗 PD-1 免疫療法已經徹底改變了MM的治療，美國 FDA 批準的免疫治療藥物 Pembrolizumab(PD-1抗體)/CTLA-4 抗體等用于治療MM能明顯延長歐美MM患者的生存時間[8,9]。PD-1(programmed death 1)程序性死亡受體1，是一種重要的免疫抑制分子。腫瘤微環境會誘導浸潤的T細胞高表達PD-1分子，腫瘤細胞會高表達PD-1的配體PD-L1和PD-L2,導致腫瘤微環境中PD-1通路持續激活，T細胞功能被抑制，無法殺傷腫瘤細胞[10-12]。有研究發現，PD-1的相對水平與T細胞產生細胞因子的能力呈負相關，在PD-1上調的T細胞中發現TNF-α、IL-2和IFN-γ等細胞因子分泌功能受限[13]。Beane等[14]利用鋅指核酸酶針對編碼PD-1基因，敲低TIL中PD-1的表達，發現敲低PD-1的TIL體外效應功能得到改善，TNF-α、GM-CSF和IFN-γ等多功能細胞因子顯著增加，在治療轉移性黑素瘤上也取得可觀的效果，并且對機體不產生不利影響。有研究發現，體外刺激后，PD-1缺陷T細胞的IFN-γ分泌和細胞毒能力增加[15,16]。而TNF-α、IFN-γ在MM中發揮著重要作用，TNF-α在體內或體外均有殺死腫瘤細胞或抑制腫瘤細胞增殖的作用。IFN-γ具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調控的作用，對于TNF-α具有刺激作用，增強抗腫瘤效應[17,18]。

PD-1雖然存在誘導表達的現象，即在活化的T淋巴細胞上高表達，但在正常的脾臟淋巴細胞中同樣也表達PD-1[19],本實驗研究發現ML中PD-1表達水平較NL顯著下降，在ConA刺激24 h后，ML組中PD-1表達依舊較NL組中顯著下降。并且在經過ConA刺激24 h之后，ML組中的TNF-α、IFN-γ表達水平均明顯高于NL組(P<0.05),并且在CCK8細胞活力實驗結果表明，NL和ML均具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，但ML的抑制作用比NL更顯著，在ConA刺激下，也證明了這一結果。這提示ML功能可能在腫瘤微環境中不易被抑制，并且分泌更高的細胞因子從而起到更好的殺傷腫瘤細胞的效果。

穿孔素是儲存在細胞毒性T細胞(CTL)和NK細胞胞質的細胞毒顆粒中的糖蛋白，顆粒酶是CTL和NK細胞釋放的細胞漿顆粒[20,21]。有研究表明，腫瘤免疫激活的CD8+T細胞主要通過穿孔素顆粒酶-和Fas/Fas配體-途徑誘導細胞死亡來執行腫瘤清除[22], 本研究在CD3陽性分選情況下，通過流式分析發現，NL組中CD8+T淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞比例分別為：25.1%、59.9%；在ML組中CD8+T淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞比例分別為：31.3%、58.9%，其中ML組中CD8+T淋巴細胞比例占比明顯高于NL組中CD8+T淋巴細胞(P<0.05)。而CD4+T細胞在兩組中差異不大。并且在Western blot中發現，ML組中穿孔素的表達水平較NL組顯著上升(P<0.05)，而顆粒酶B在未激活的免疫細胞是不表達的；使用ConA刺激24 h后，ML組中穿孔素、顆粒酶B的表達水平也較NL組顯著上升(P<0.05)；流式分析發現ConA刺激24 h后，ML組中CD8+T細胞表達的顆粒酶B的比例也相對NL組更高，ML組(17.8%)較NL組(14.3%)提高了24.5%；而穿孔素的表達比例，ML組(11.3%)較NL組(8.78%)提高了28.7%。這也提示，ML相對于NL具有更強的抗腫瘤作用。

綜上所述，黑素瘤小鼠的脾臟淋巴細胞具有更明顯的抑瘤效應，可能通過低表達PD-1以及能夠分泌更高的穿孔素、顆粒酶B以及TNF-α、IFN-γ等而實現。作為初步探究，我們在本研究中并未對這種現象是否具有特異性的進行驗證，我們將在后面的研究中進行跟進。并且僅在細胞層面得出結論，仍需通過動物實驗進一步驗證。由于脾臟淋巴細胞易獲取、數量多，希望這一研究發現能為MM的過繼性免疫治療提供新的思路。