基于響應(yīng)面法對衛(wèi)紅花中紅花黃色素提取條件的優(yōu)化*

王婷婷，王鑫蒙，李金平，蘇亞東，李 爽， 邢沂海，李保林，張 偉，郭 嬌

(1 新鄉(xiāng)學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2 鑫福林衛(wèi)紅花種植專業(yè)合作社，河南 新鄉(xiāng) 453003)

衛(wèi)紅花又名黃藍(lán)花、紅藍(lán)花、草紅花及紅花草，為菊科植物紅花的干燥花。衛(wèi)輝衛(wèi)紅花為“豫北三花”之一，在衛(wèi)輝市有2000多年的栽培歷史，并以其“量高質(zhì)佳、蕊長色紅、手抓油潤、勁攥不折、藥香撲鼻”的特征馳名全國，并在國際市場上享有盛譽，為全國農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志[1-2]。

衛(wèi)紅花的可利用資源主要集中在紅花籽和花冠，紅花籽的經(jīng)濟(jì)價值主要在于提取紅花籽食用油，紅花籽食用油具有穩(wěn)定血壓，降低膽固醇等作用[3]；紅花花冠含豐富的天然紅花黃色素和紅色素，可用于提取色素。紅花中紅花黃色素含量最高，黃色素中又以羥基黃色素A含量最高。紅花黃色素易溶于水，一般用作食用天然色素，著色效果好，在食品體系中性質(zhì)穩(wěn)定，且兼具治療心腦血管疾病、降血脂、抗氧化等活性功能[4]，具有較大的市場潛力，多年來一直是科研的熱點。

1 紅花黃色素的提取材料與方法

1.1 材料與儀器

衛(wèi)紅花，鑫福林衛(wèi)紅花種植專業(yè)合作社；對照品羥基紅花黃色素A，中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，分析純；0.2 μm水系微孔過濾膜，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；定性濾紙，杭州特種紙業(yè)有限公司。

Scientz-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司；ME104EV02電子天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KQ-100VDV雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-1600紫外可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅花黃色素的提取

干燥紅花粉碎后過40目篩，準(zhǔn)確稱取1.00 g紅花粉末與錐形瓶中，以蒸餾水為提取溶劑，預(yù)浸泡2 h，以液料比為 10:1(V/w)，溫度25 ℃，超聲(100 W，45 kHz)提取 20 min，提取一次，用布氏漏斗過濾，取上清液過0.2 μm微孔濾膜，定容并稀釋一定倍數(shù)后，在403 nm波長處測定其吸光度[5]，并將其結(jié)果帶入公式(1)計算提取率。

1.2.2 羥基紅花黃色素A的標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

準(zhǔn)確稱量1.5 mg羥基紅花黃色素A對照品，置于10 mL容量瓶并加蒸餾水稀釋至刻度線；分別精密量取羥基紅花黃色素A對照品溶液0.5、0.8、1.0、1.3、1.6、2.0 mL于5 mL量瓶內(nèi)加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻后即得到不同濃度的羥基紅花黃色素A溶液。使用紫外可見分光光度計以蒸餾水為空白，在403 nm波長處測定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，羥基紅花黃色素A濃度為縱坐標(biāo)繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]。由羥基紅花黃色素A濃度和吸光度得到的回歸方程為y=0.0829x-0.0036，R2=0.9995，y的單位為mg/mL。

1.2.3 紅花黃色素含量計算[6]

(1)

式中：f—稀釋倍數(shù)

A—403 nm處吸光度

V—濾液總體積/mL

m—干紅花質(zhì)量/g

1.2.4 黃色素提取單因素試驗

設(shè)置不同梯度的超聲時間(20，30，40，50，60 min)、超聲溫度(20、40、50、60、70、80 ℃)、提取次數(shù)(1、2、3次)和液料比為V(蒸餾水)：w(紅花)=6、8、10、12、15、 20 mL/g，以黃色素提取率為評價指標(biāo)，考察提取溫度、提取次數(shù)、提取時間及液料比對紅花黃色素提取的影響[7]。

1.2.5 黃色素提取條件優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，運用Design Expert 11軟件程序根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，以紅花黃色素的提取率(Y)為響應(yīng)值，以對紅花黃色素提取率影響顯著的4個因素超聲時間(X1)、液料比(X2)、提取溫度(X3)和提取次數(shù)(X4)為考察因素，Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 紅花黃色素提取工藝條件優(yōu)化 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test for optimization of extraction conditions of safflower yellow pigment

2 紅花黃色素的提取結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗紅花黃色素提取工藝的優(yōu)化

2.1.1 超聲時間對紅花黃色素提取率的影響

紅花黃色素的提取率在超聲提取30 min內(nèi)達(dá)到最大(圖1)，提取時間超過30 min之后提取率逐漸下降，說明30 min后提取時間過長導(dǎo)致黃色素被破壞，因此長時間的提取在生產(chǎn)過程中不僅會延長生產(chǎn)周期，而且會增加能耗，使生產(chǎn)成本增加，所以提取時間30 min較為適宜。

圖1 不同提取時間下紅花黃色素的提取率Fig.1 Extraction rate of safflower yellow pigment under different extraction time

2.1.2 液料比對提取率的影響

如圖2所示，液料比在10:1之前由于溶劑量較小不能將紅花粉末潤濕，所以提取率很低，液料比在10:1之后，由于溶劑量不斷增加紅花樣品得到充分潤濕，提取率有一定程度的提高，且變化較為平穩(wěn)，說明紅花黃色素擴(kuò)散體系達(dá)到平衡，在料液比為12:1之后再增加溶劑用量會增加生產(chǎn)成本，因此在確保提取率的條件下選擇適宜溶劑用量[8]，故料液比為12:1(V/w)時提取率最大。

圖2 不同液料比下紅花黃色素的提取率Fig.2 Extraction rate of safflower yellow pigment at different liquid-solid ratio

2.1.3 超聲提取溫度對紅花黃色素提取率的影響

如圖3所示，隨著超聲溫度不斷升高，紅花黃色素的提取率先增加后減少，當(dāng)溫度升到40 ℃時，紅花黃色素提取率最高。當(dāng)溫度持續(xù)升高時，紅花黃色素提取率反而降低，說明了紅花黃色素隨著加熱時間增長受到破壞，熱穩(wěn)定性較差，因此選擇紅花黃色素適宜超聲提取溫度為40 ℃。

圖3 不同提取溫度下紅花黃色素的提取率Fig.3 Extraction rate of safflower yellow pigment at different temperature

2.1.4 提取次數(shù)對提取率的影響

如圖4所示，提取2次時紅花黃色素的提取率達(dá)到最大，2次之后紅花黃色素的提取率沒有提高，說明紅花黃色素2次可以被提取完，持續(xù)增加提取次數(shù)也不能提高提取率，從生產(chǎn)角度考慮，為了降低生產(chǎn)成本，選擇提取次數(shù)2次時提取率最高。

圖4 不同提取次數(shù)下紅花黃色素的提取率Fig.4 Extraction rate of safflower yellow pigment at different extraction times

2.2 響應(yīng)面分析實驗

2.2.1 實驗設(shè)計及結(jié)果

運用Design Expert 11軟件對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得回歸方程：

表2 紅花黃色素提取工藝條件優(yōu)化 Box-Behnken實驗結(jié)果與分析Table 2 Box-Behnken test results and analysis of optimization of extraction conditions of safflower yellow pigment

續(xù)表2

對上述回歸方程進(jìn)行方差分析，得到結(jié)果表見表3。

表3 響應(yīng)面實驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments results

續(xù)表3

2.2.2 響應(yīng)面分析

超聲提取時間、液料比、提取溫度和提取次數(shù)交互作用對紅花黃色素提取率影響的響應(yīng)面曲線及等高線見圖5。

圖5 各因素交互作用紅花黃色素提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface and contour of the interaction of various factors on the extraction rate of safflower yellow pigment

由圖5可知，當(dāng)固定超聲提取時間，隨著液料比、提取次數(shù)、溫度的增大，紅花黃色素的提取率都是呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，液料比在11～13(V/w)、提取時間在25～35 min時等高線為閉合的橢圓形而且響應(yīng)面呈凸形，說明提取時間和液料比的交互作用具有最大值；提取次數(shù)在1.5～2.5次、時間在25～35 min時等高線未閉合但是響應(yīng)面呈凸形，說明二項式提取次數(shù)影響大；提取溫度在32～38 ℃的范圍、時間在25～ 35 min時等高線為閉合的橢圓形而且響應(yīng)面呈凸形，說明提取時間和提取溫度的交互作用具有最大值；上述分析和表3中的顯著性一致。

利用Design Expert 11軟件對所得的回歸方程進(jìn)行回歸分析，確定最佳工藝參數(shù)時間31.706 min、料液比13.671(V/w)、提取溫度36.576 ℃、提取次數(shù)2.144次，此時紅花黃色素提取率預(yù)測值為37.768%。為了方便實際操作，將最佳工藝參數(shù)修改為提取時間32 min、料液比13.5(V/w)、提取溫度37 ℃、提取次數(shù)2次，在此最優(yōu)條件下，紅花黃色素的提取率為36.95%，與模型預(yù)測值(37.768%)較一致，驗證了模型的可靠性。

3 結(jié) 論

通過對超聲時間、料液比、提取溫度、提取次數(shù) 4 個因素進(jìn)行單因素試驗，再通過 Design Expert 軟件對紅花黃色素提取率響應(yīng)值進(jìn)行回歸，得出提取次數(shù)和液料比對結(jié)果影響顯著。通過單因素實驗和響應(yīng)曲面法確定紅花黃色素提取的最佳工藝參數(shù)：提取時間32 min、料液比13.5(V/w)、提取溫度37 ℃、提取次數(shù)2次，在此最優(yōu)條件下，紅花黃色素的提取率為36.95%。

本研究采用超聲波輔助水提取紅花黃色素操作方法簡單、成本低，確定了工業(yè)化合理提取紅花色素的理想模型，為衛(wèi)紅花的深加工和其色素作為功能產(chǎn)品在食品添加中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)依據(jù)。