“金課”背景下探究性藥學實驗的設計與實踐*

孔繼川，李 楊，周景春

(1 河南理工大學，河南 焦作 454000； 2 北京本草方源藥業集團有限公司,北京 102600)

在藥學高等教育中如何培養動手能力強，專業素質高的藥學人才是實驗教學改革研究的重點課題，也是我國藥學人才培養的重要目標[1-2]。藥學實驗是培養學生實踐能力和創新能力的重要環節。目前藥學高等教育中藥學實驗課程內容相對陳舊，驗證性實驗較多，不能滿足藥學創新型和復合型應用人才培養要求，亟須對藥學實驗教學進行改革與創新。2018年教育部提出“建設中國金課”，即課程要具備高階性、創新性和挑戰度。“高階性”，是指知識、能力與素質的有機融合；“創新性”，指課程內容有前瞻性和時代性，教學形式呈現先進性和互動性，學習結果具有探究性和個性化；“挑戰度”，指課程有一定難度，需要跳一跳才能夠得著。按照“兩性一度”金課標準，探索構建設計性、與生產實踐和專業課程知識融合的探究性實驗項目，讓學生依據企業見習和文獻調研并利用所學藥學專業知識進行實驗方案的設計和準備，提升藥學實驗教學的創新性和挑戰度，培養學生創新思維和解決問題的能力。

中醫藥作為現代醫學重要組成部分在疫情防控和諸多疾病治療中發揮了重要作用[3]，伴隨著中藥分離提取技術不斷進步和中藥有效成分的藥用機制的深入研究，中藥活性成分制劑在諸多疾病治療中的作用越來越受到科研工作者的關注[3-4]。金銀花為常用中藥材，具有抗病毒，降血脂，降血糖等功能[5]。研究發現，金銀花是2019-nCoV肺炎的潛在治療藥物[6]。綠原酸是金銀花中主要成分，具有抗菌，抗氧化，抗病毒，抗腫瘤等多種藥理活性，已成為中藥活性物質研究的熱點之一[7-8]。目前金銀花中綠原酸的提取尚無固定工業化提取工藝[9-10]。文章以中藥材金銀花中綠原酸提取工藝為例，探索設計藥學探究性綜合實驗，培養學生實踐創新能力，為藥學實踐性“金課”建設提供有益的實踐教學案例。

1 實驗的技術背景和設置思路

金銀花中綠原酸提取方法有水提法、醇提法、索氏提取法、超聲提取法等。 水提法經濟易行，但提取率低[4]，且水溶性雜質多，不易純化。醇提法用乙醇做溶媒，提取液雜質少，不易變質，便于后續加工，是綠原酸提取的常用方法。超聲輔助提取法利用超聲波的空化作用釋放金銀花中的綠原酸，提取效率高且不易破壞活性物質。索氏提取法利用溶媒的蒸發冷凝回流多次溶解萃取物質有效成分，溶媒用量少，雜質含量少。文章設計以金銀花為原料，分別采用水提法、超聲提取法和索氏提取法對金銀花中綠原酸進行提取，并以紫外可見分光光度法對其含量進行測定，以期找到一種方便易行，適合工業化生產綠原酸提取工藝，使實驗研究反饋于生產實踐，培養學生學以致用服務社會的責任擔當。

影響綠原酸提取工藝的因素有溫度、時間、溶媒和料液比等。為便于比較各種提取方法的提取效率，實驗采用固定料液比、提取時間、提取溫度和循環次數，考察不同提取方法的提取效率。由綠原酸結構式(圖1)可知綠原酸是一種酚酸類化合物，由于具有羧基和鄰二酚羥基的結構，其含較多親水基團，所以提取溶媒可作為考察綠原酸提取效率重要因素，據文獻報道索氏提取法提取效率相對較優[11]，因此實驗比較水提法、超聲提取法和索氏提取，并重點考察溶劑極性對索氏提取法提取效率的影響，引導訓練學生分析和解決問題能力的同時，以期實驗結果能為綠原酸的工廠化生產提供理論支撐。在綠原酸含量測試方法選擇上引導學生依據綠原酸結構分析綠原酸可產生紫外吸收且極性大，可用高效液相色譜法和紫外分光光度法測定綠原酸含量。高效液相色譜法準確度高但操作繁瑣，耗時長，而紫外分光光度法操作簡便，在藥學專業實驗中也是最常用的定量測試方法，在有限的學時內也便于完成操作，因此實驗采用紫外可見分光光度法對綠原酸進行定量。

圖1 綠原酸結構式Fig.1 Molecular structure of Chlorogenic acid

2 實驗的具體內容

2.1 實驗目的

通過探索性實驗設計打破學生原有驗證性實驗固有思維模式，拓展學生對中藥提取工藝的認識，熟悉設定提取工藝考察參數和建立定量鑒別方法的依據，掌握提取實驗所用儀器的操作方法，了解實驗方案設計的基本思路，培養學生的科研思維技能。要求掌握實驗數據的處理方法，并能依據工業生產需求得出切合實際的結論，培養學生實事求是的科研作風。

2.2 實驗的設計

2.2.1 綠原酸的提取工藝

(1)水提取法：稱取金銀花粉末12.00 g，加入200 mL蒸餾水，在錐形瓶中溶解，置于90 ℃下1 h，抽濾，將濾渣加入200 mL蒸餾水重復上述步驟，合并濾液后離心(3000 r/min， 11 min)，清液減壓蒸餾(40 ℃)濃縮至30 mL，置于4 ℃冰箱中待用；

(2)超聲提取法：稱取金銀花粉末12.00 g，加入200 mL蒸餾水，在90 ℃下超聲1 h，抽濾，濾渣加入200 mL蒸餾水后重復上述步驟，合并濾液后離心(3000 r/min，11 min)，清液減壓蒸餾(40 ℃)濃縮至30 mL，置于4 ℃冰箱中待用；

(3)索氏提取法：稱取金銀花粉末12.00 g置于索氏提取器中，分別用80%甲醇，無水乙醇，乙酸乙酯各100 mL進行提取1 h，將提取液在40 ℃下減壓濃縮至30 mL，冷卻后置于 4 ℃冰箱中待用。

(4)拓展：提取工藝中藥材取樣量、溶媒體積和提取時間等可根據實驗室條件和教學需要進行適時調整，為便于方案對比建議三種方案取樣量、溶媒體積和提取時間保持一致，當然也可以針對一種提取方式，在固定固液比條件下，改變提取時間、溫度和溶劑配比優化最佳提取工藝，賦予實驗操作靈活性，給學生提供自我發揮的空間，實現實驗的自控性和探究性特點。

2.2.2 綠原酸對照品標準曲線的繪制

(1)稱取10 mg綠原酸標準品，用60%乙醇稀釋定容至 50 mL，得綠原酸標準儲備液，分別移取儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL定容，在326 nm下測定各溶液吸光度值，以吸光度值為縱坐標，標準樣品質量濃度為橫坐標繪制工作曲線，線性擬合得到線性回歸方程。

(2)拓展：對照品濃度和標準溶液的移取體積及溶劑學生可以自行調控，但要有文獻依據，讓學生了解科研實驗設計要有規可循。

2.2.3 綠原酸樣品溶液的制備和含量測定

(1)采用逐級稀釋法將上述提取液稀釋適當倍數作為樣品溶液，以相應體積比的乙醇作為空白，用紫外可見分光光度計測定樣品溶液的吸光度，利用回歸方程計算供試品綠原酸含量。為提高實驗準確度，每個提取工藝重復3次，培養學生嚴謹的科研作風。

(2)回收率試驗：取空白殘渣樣品，每份稱取 5 g，分別加入綠原酸對照品溶液適量，配置成濃度分別為5、10、15 μg/mL的對照品溶液，每個質量濃度 3份，制備供試品溶液，檢測，計算回收率。

(3)準確度和精密度試驗：空白樣品按 2、5、8 μg/g 3 個水平添加標準品，每個水平平行測定 6 次，考察方法的準確度與精密度。

(4)拓展：探討設計高效液相色譜法定量測定綠原酸的方法，并與紫外分光光度法測定結果進行對照，檢驗方法的準確度。

3 實驗過程

3.1 實驗前準備

本階段主要是根據學生所學專業基礎知識和醫藥企業見習了解的藥物提取及質量監控相關知識，查閱相關文獻和資料完成以下準備工作。

(1)了解綠原酸結構性質，中藥提取工藝流程所涉及各種參數，學習綠原酸提取工藝參數選擇與優化方法，初步設定工藝優化參數，培養學生科研實驗設計能力；

(2)了解中藥提取工藝質量監控方法，掌握相關儀器設備，比如紫外分光光度計、超聲波清洗機、索氏提取等實驗裝置的操作方法，培養學生動手操作能力；

(3)根據實驗設計目標，學生成立實驗小組討論確定綠原酸提取工藝參數，制定工藝優化策略，設計詳細的實驗步驟，培養學生分析解決問題能力和科研合作精神。

3.2 實驗安排

本實驗為藥學專業四年級本科生第七學期醫藥企業見習周開設，在醫藥企業見習周先安排兩天的醫藥企業見習內容，然后根據文獻調研和醫藥企見習了解的中藥提取工藝所涉及問題開設本次實驗，總學時30學時，具體安排如下：理論講解2學時，綠原酸含量測定方法建立2學時，綠原酸各種提取工藝操作20學時，實驗數據處理，繪圖與數據分析5學時。試驗完成后要求學生撰寫科研小論文，制作PPT對實驗過程和實驗結果進行總結，匯報、交流和討論。

3.3 課上實驗操作

(1)按照設計的實驗步驟，依據儀器分析和藥物分析實驗藥品定量測定操作要求，準確配置綠原酸對照品標準溶液，并利用紫外分光光度計在設定波長下測定標準溶液的吸光度值，利用數據處理軟件Excel或 origin作圖并進行線性擬合，得到綠原酸含量測定線性回歸方程y=0.027x-0.0012(r=0.9998)。

(2)按照設計的實驗步驟，設定綠原酸提取方案，依據不同提取方法并依次按照醇水、乙醇和乙酸乙酯不同溶媒設計提取試驗工藝，按照設計的實驗步驟，測定不同方案下綠原酸綜合得率。

綠原酸的提取率按下式計算：

式中：K為稀釋倍數;V為減壓蒸餾后的溶劑體積,mL;C為測定的綠原酸質量濃度,mg/mL;w為稱取的金銀花的質量,g。

3.4 課后探究分析

本階段主要是對實驗結果進行分析，總結數據規律，對試驗中出現的問題及可能對實驗產生影響的因素進行分析和探討，側重于學生面向工廠生產的實際問題進行分析和探討，鍛煉學生分析問題和解決問題的能力。

表1 綠原酸的提取工藝設計實例Table 1 Example of extraction process design of chlorogenic acid

(1)結果分析

讓學生根據實驗結果分析不同提取工藝提取效率，依據醫藥企業見習中所了解的關于藥物提取工藝知識對所得結果的合理性做出判斷。實驗結果表明：由于綠原酸極性較大，所以極性大溶劑更有利于綠原酸的提取。在索氏提取方法中甲醇作為提取溶媒時效果最優，提取得率為3.79%。隨著提取溶媒極性降低，綠原酸的提取效率依次降低，由此可得出：除提取技術外，提取溶媒極性可能是影響提取效率的主要因素，在提取工藝一定的情況下應盡可能選擇極性大的溶媒。該實驗研究結果既能為工業提取工藝設置提供理論依據，也提升了學生對專業學習的認同度。

(2)回收率試驗

空白樣品添加綠原酸標準工作液，按照2.3.3項下方法制備供試品溶液，檢測，計算回收率，結果顯示平均回收率分別為 98. 45%、99. 59%、98. 32%，RSD = 0. 81%。

(3) 準確度和精密度試驗

空白樣品按 2、5、8 μg/g 3 個水平添加標準品，每個水平平行測定 6 次，考察方法的準確度和精密度，結果見表3。 表3表明綠原酸的平均回收率介于 84.6%～87.8%之間，變異系數≤9.6%，說明該定量方法有良好的準確度和精密度。

表2 綠原酸提取工藝結果Table 2 Results of chlorogenic acid extraction process

表3 不同樣品中添加綠原酸的R及RSDTable 3 The recovery rate and relative standard deviation of chlorogenic acid in different concentrations of samples

(4)實驗總結。按照科技論文格式撰寫實驗報告，包括分析實驗數據并得出結論，總結實驗設計心得與操作注意事項，鍛煉學生科研論文寫作能力。

(5)實驗拓展。為滿足學生科研探索需求，可設計探索提取工藝溶媒配比變化對提取效率的影響，為綠原酸工業生產探索最佳生產工藝。另外，高效液相色譜法在藥物定量分析中具有獨特優勢，可以拓展高效液相色譜對綠原酸的定量方法并與紫外可見分光光度法進行對比，檢驗結果的可信度，培養學生嚴謹的科學態度。

4 結 語

以培養學生的創新能力和實踐能力為目的，設計了探究性藥學專業實驗—金銀花中綠原酸的提取工藝研究。實驗設計過程需要學生借助分析化學、儀器分析、藥物分析、天然藥物化學、文獻檢索與寫作、實驗設計與數據處理等多門專業課程的理論知識與企業見習所學實踐知識設計綠原酸提取方法和工藝，實現了專業知識與實踐技能的融合。綠原酸提取工藝的優化以綠原酸的性質為基礎確定影響提取效率的重要因素，試驗工藝的設定參照文獻調研和企業見習，實驗過程差異性和實驗結果的不確定性，提高了實驗挑戰度，可有效培養學生科研素質。實驗前文獻調研和教師的講解相結合，可開闊學生的視野，鍛煉學生查閱、整理資料以及設計實驗的能力。實驗中提取表征設備使用、實驗數據處理分析及繪圖等培養學生動手操作能力，同時為滿足學生科學探索需求對可實驗內容實時拓展，提高學生的科研能力和創新精神，為日后從事科研或走向專業技術崗位奠定堅實的基礎。文章所設計的探究性實驗即可作為高年級藥學專業的綜合性實驗，也可作為高年學生創新創業訓練項目，是對藥學專業實驗教學改革的嘗試和探索。在當前創新創業教育背景下，需要依據科研生產發展趨勢和“金課”標準改革現有的教學內容和教學方式，探究性綜合實驗改變了驗證性實驗的教學模式，讓學生更主動的參與到實驗教學過程，由于實驗設計貼近科研和生產實踐，在文獻調研和試驗工藝設計過程中訓練學生的科研創新能力，融合了科研育人功能，提高了課程的挑戰度。由于實驗設計融合了醫藥企業生產實踐，實驗結果可為醫藥企業中藥提取提供理論參考，實現研以致用，增加學生專業認同度。當然藥學探究性實驗的實施在要求學生改變原有的實驗學習思維的同時，作為實驗教學的高校教師首先要努力更新教學理念，轉換教學角色，緊跟“金課”步伐，感知學生的教與學，與學生形成共同體，運用嚴謹的全腦教學原則設計課程[12]。在目前我國線下“金課”打造無論是數量還是品質還處于緩慢發展階段及相關研究薄弱的背景下，探索藥學專業實踐性“金課”建設案例具有重要實踐意義。