憂遁草中黃酮苷的分離純化以及對(duì)上皮性卵巢癌抗腫瘤作用的研究

隋紅梅 賀鳳喜 李愛華 李愛峰 王麗 路煥喜

1聊城市婦幼保健院婦科，聊城 252000；2聊城市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，聊城 252000；3聊城大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，聊城 252000；4聊城市東昌府區(qū)人民醫(yī)院婦科，聊城 252000通信作者：李愛華，Email：18663529788@126.com；李愛峰，Email：lxpsdta2001@sina.com

晚期上皮性卵巢癌具有高復(fù)發(fā)率、高病死率的特點(diǎn)［1］，鉑耐藥是所有患者的共同歸宿，也是主要致死原因［2-3］，尋找新型抗腫瘤藥物成為亟待解決的問題。憂遁草是一種傳統(tǒng)中藥材，廣泛分布于我國(guó)南部至西南部地區(qū)［4］，黃酮苷是其主要成分，對(duì)多種癌癥有抑制作用，如：乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、肺癌等［5］，但在上皮性卵巢癌中的研究中鮮有報(bào)道。本研究（研究時(shí)間：2019 年10 月至2022 年3 月）旨在分離純化憂遁草中的黃酮苷成分，探討其對(duì)于上皮性卵巢癌的作用及潛在機(jī)制，為卵巢癌的化學(xué)藥物治療及憂遁草藥用價(jià)值的開發(fā)提供理論依據(jù)。

材料與方法

1、實(shí)驗(yàn)材料

上皮性卵巢癌細(xì)胞A2780、SKOV3、OVCAR3 均由聊城市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；DMEM 高糖培養(yǎng)基、CCK-8（cell counting kit-8）試劑盒、總RNA提取試劑（Trizol）、M-MuLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒（B532435）、2xSG Fast qPCR Master Mix（Low Rox）（B639272）、GAPDH

引物（正向：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'；反向：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'）、Bcl-2 引物（正向 ：5'-GACTTCGCCGAGATGTCCAG-3' ；反 向 ：5'-GAACTCAAAGAAGGCCACAATC-3'）、Beclin-1 引物（正向：5'-ACATCTGGCACAGTGGACAGTTTG-3' ；反 向：5'-AGCATGGAGCAGCAACACAGTC-3'）、RIPA 裂解液、5X蛋白加樣緩沖液、Anti-BECN1 antibody、HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG、Anti-BCL2（Pho-spho-Thr69）antibody、HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG、蛋白預(yù)染Maker、苯甲基磺酰氟、30%Acr-Bis（29：1）溶液、1M Tris-HCL，pH=8.8、10%SDS 溶 液、1M Tris-HCL，pH=6.8、10X Tris-Glycine SDS-PAGE 電泳緩沖液、10X 印跡膜轉(zhuǎn)印緩沖液、PVDF 印跡膜、10X TBST WB 漂洗液、Annexin V 凋亡檢測(cè)試劑盒（均購(gòu)至生工生物工程股份有限公司）。

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1、憂遁草中黃酮苷的提取、分離純化和鑒定 將憂遁草粉碎，用20 倍量75%乙醇超聲提取3 次，每次30 min，過濾，提取液經(jīng)減壓濃縮得粗提物。用HPD-100 型大孔吸附樹脂對(duì)粗提物中的黃酮苷進(jìn)行富集，上樣后首先用水洗脫10 個(gè)柱體積以除去強(qiáng)極性雜質(zhì)，再用40%乙醇-水溶液洗脫7 個(gè)柱體積將黃酮苷洗脫下來。用半制備型高效液相色譜儀對(duì)富集后的黃酮苷進(jìn)行分離純化，色譜柱為C18（250.0 mm×25.4 mm，10 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（34：66，V/V），流速為25 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，柱溫為室溫。根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集目標(biāo)組分餾分，減壓濃縮除去溶劑，其純度用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振波譜分析進(jìn)行鑒定。

2.2、細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%滅活胎牛血清和1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代細(xì)胞，于5%CO2、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)使用0.25%的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，DMEM 培養(yǎng)基終止消化并離心，DMEM重懸后接種于培養(yǎng)皿中。

2.3、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵巢癌細(xì)胞消化離心，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞均勻接種于96 孔板中，并放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將憂遁草黃酮苷提取物用甲醛溶解，按照10 μg/μl、20 μg/μl、40 μg/μl、60 μg/μl、80 μg/μl、100 μg/μl 的濃度梯度作用于細(xì)胞，每個(gè)濃度有3個(gè)副孔，分別處理24 h、48 h。然后向每孔中加入CCK-8溶液（每孔100 μl 加 入10 μl CCK-8 溶液）。以加入等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）作為空白對(duì)照組。在37 ℃孵育2 h 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光值（OD）。

2.4、細(xì)胞凋亡檢測(cè) 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將上皮性卵巢癌細(xì)胞用DMEM 完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，接種5 ml 于T25培養(yǎng)瓶中，放置在環(huán)境溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的孵化箱中24 h，使細(xì)胞貼壁。將提取物以不同的濃度作用于細(xì)胞，置入5%CO2孵箱37 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使每管中含有1×106個(gè)細(xì)胞。根據(jù)Annexin V Binding Apoptosis Assay Kit（E607127）試劑盒說明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.5、熒光定量PCR 檢測(cè) 根據(jù)RNA 提取試劑盒說明書，將經(jīng)憂遁草黃酮苷提取物處理后的細(xì)胞進(jìn)行RNA 提取，根據(jù)M-MuLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒（B532435）說明書操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)Bcl-2 與Beclin-1 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量，mRNA 的相對(duì)表達(dá)量按照公式2–ΔΔCt計(jì)算。

2.6、Western-blot 檢測(cè) 提取經(jīng)憂遁草黃酮苷提取物處理后細(xì)胞中的總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白的濃度，加入適量蛋白上樣緩沖液，調(diào)整為相同蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳后將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h 后，分別加入Bcl-2、Beclin-1 的一抗，4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次后加入二抗，室溫孵育1 h 后，再用TBST 洗膜3 次。在PVDF膜上加入適量的顯影液，在蛋白顯影儀顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0、GraphPad Prism 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行細(xì)胞半抑制濃度（IC50）值的測(cè)定，應(yīng)用GraphPad Prism 進(jìn)行作圖分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1、憂遁草中黃酮苷的結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)核磁共振波譜3 種黃酮苷分析為：肥皂草苷、夏佛塔苷和牡荊苷，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。相關(guān)成果已獲國(guó)家級(jí)發(fā)明專利（專利號(hào)：ZL 2019 1 0261971.4）。

圖1 憂遁草中3種黃酮苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式（A為肥皂草苷，B為夏佛塔，C為苷牡荊苷）

2、憂遁草黃酮苷對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和空白組相比，經(jīng)3 種不同憂遁草黃酮苷提取物處理24 h 后，牡荊苷對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞具有明顯增殖抑制作用（P<0.05），而肥皂草苷、夏佛塔苷對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞無明顯增殖抑制作用（圖2）。牡荊苷對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3、OVCAR3、A2780 的IC50值分別為33.777 μg/μl、34.114 μg/μl、31.968 μg/μl。這說明牡荊苷對(duì)上皮性卵巢癌具有抗癌活性，后續(xù)研究以牡荊苷為研究對(duì)象。

圖2 憂遁草中黃酮苷提取物對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖影響(A為肥皂草苷，B為夏佛塔苷，C為牡荊苷)

3、牡荊苷對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3、A2780、OVCAR3中Beclin-1、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

與空白組相比，經(jīng)牡荊苷處理后，上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3、A2780、OVCAR3 組Beclin-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量增加，Bcl-2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。后續(xù)研究以SKOV3為研究對(duì)象。

表1 憂遁草提取物牡荊苷對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞Beclin-1、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

4、牡荊苷對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3 的生長(zhǎng)抑制作用

以不同濃度的牡荊苷（0、20、30、40 μg/μl）分別處理卵巢癌SKOV3 細(xì)胞24 h 后，使用Annexin V Binding Apoptosis Assay Kit 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)憂遁草提取物牡荊苷對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果顯示：隨著牡荊苷濃度的增加，其對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3 的生長(zhǎng)抑制作用越顯著（P<0.01）。見圖3。

圖3 憂遁草黃酮苷提取物牡荊苷對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用（A為流式細(xì)胞檢測(cè)圖，B為細(xì)胞凋亡率柱狀圖）

5、憂遁草提取物牡荊苷對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3中Beclin-1、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)牡荊苷處理后，通過Western-Bolt技術(shù)檢測(cè)空白組和藥物組中Beclin-1、Bcl-2 蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：經(jīng)牡荊苷處理后，上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3 中Beclin-1 蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯減少（P<0.01）。見圖4。

圖4 憂遁草提取物牡荊苷對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞中Beclin-1 和Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響（空白對(duì)照組：加入等體積的磷酸鹽緩沖液，藥物組：Beclin-1 和Bcl-2 蛋白抗體滴液1∶5 000）

討論

晚期卵巢癌是一個(gè)多次復(fù)發(fā)的“慢性”疾病，70%的患者停止化療后3 年內(nèi)復(fù)發(fā)，需要接受二線乃至多線治療，隨著復(fù)發(fā)次數(shù)增加，無進(jìn)展生存期逐漸縮短，蓄積毒性日益顯著，最終發(fā)展為對(duì)鉑類耐藥［6-7］。鉑耐藥患者預(yù)后差，化療推薦非鉑方案，總有效率不足20%，中位無進(jìn)展生存期3～4 個(gè)月，中位總生存時(shí)間不足12 個(gè)月。中藥有效成分在抗腫瘤方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，具有多途徑、多靶點(diǎn)、低毒性的特點(diǎn)，開發(fā)新型抗腫瘤藥物已成為了卵巢癌研究的熱點(diǎn)。

1、憂遁草中牡荊苷對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞具有明顯增殖抑制作用

憂遁草是一種多年生草本植物，具有很高的藥用價(jià)值，研究表明憂遁草具有多種生物活性［5，8］，如抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤生長(zhǎng)等。本研究從憂遁草中分離提純出3 種黃酮苷化合物，分別為肥皂草苷、夏佛塔苷和牡荊苷（相關(guān)成果已獲國(guó)家級(jí)發(fā)明專利，專利號(hào)：ZL 2019 1 0261971.4），CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)3 種提取物處理后，僅牡荊苷對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞具有明顯增殖抑制作用，肥皂草苷、夏佛塔苷無明顯增殖抑制作用，說明憂遁草中黃酮苷化合物的異質(zhì)性。

2、憂遁草中牡荊苷通過促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種主要形式，在調(diào)節(jié)多細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和維持細(xì)胞穩(wěn)定數(shù)量過程中發(fā)揮重要作用［9-10］，細(xì)胞凋亡一旦受抑制，就會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展［9，11］。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2 家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜的細(xì)胞質(zhì)上［12］，Bcl-2 在多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)升高，通過抑制細(xì)胞程序性死亡，促進(jìn)癌癥的發(fā)生［10，13］。本研究結(jié)果顯示，牡荊苷對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞具有明顯增殖抑制作用（P<0.05），并隨著牡荊苷濃度的增加，生長(zhǎng)抑制作用越顯著（P<0.01），表明牡荊苷的生長(zhǎng)抑制作用呈劑量-時(shí)間依賴性；經(jīng)牡荊苷處理后，上皮性卵巢癌細(xì)胞Bcl-2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低（P<0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯減少（P<0.01）。可見，憂遁草中牡荊苷通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，這與Zhao 等［14］研究結(jié)論一致。同樣，也有研究發(fā)現(xiàn)憂遁草提取物對(duì)MCF-7 乳腺癌細(xì)胞具有抗增殖活性，可有效縮小4T1 乳腺癌小鼠模型腫瘤體積［15］，另外，也有研究證實(shí)憂遁草提取物可影響宮頸癌Hela 細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡［16］。

3、憂遁草中牡荊苷通過調(diào)節(jié)Bcl-2 與Beclin-1 的相互作用控制卵巢癌細(xì)胞自噬，促進(jìn)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞自噬又稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡［17］，是一把雙刃劍，具有保護(hù)和破壞作用，一方面通過溶酶體途徑去除受損的細(xì)胞器、有毒代謝物和病原體，并產(chǎn)生能量維持細(xì)胞的生存，另一方面，細(xì)胞內(nèi)重要成分的過度自我消化和降解也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡［13］。細(xì)胞自噬與腫瘤的關(guān)系非常密切，在腫瘤發(fā)生的初期階段，細(xì)胞自噬可抑制腫瘤的發(fā)生，隨著腫瘤進(jìn)展，自噬可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，還可通過促血管生成促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［9，11］。

Beclin-1是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)參與自噬過程的基因，定位于人類第17q21 號(hào)染色體，在自噬中發(fā)揮核心作用［17］，編碼Beclin-1 蛋白，是啟動(dòng)自噬體形成的必需蛋白，調(diào)控自噬前體的形成［9，17］。Beclin-1 最初是作為Bcl-2 的交互蛋白被分離出來，近年來研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2通過與Beclin-1相互作用發(fā)揮抗自噬作用，Beclin-1/Bcl-2 復(fù)合物在細(xì)胞中起著變阻器功能，Bcl-2不僅通過與含有BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白結(jié)合來抑制細(xì)胞凋亡，而且通過與Beclin-1 的BH3 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子信號(hào)，調(diào)節(jié)自噬，BH3結(jié)構(gòu)域可能是一個(gè)共同的結(jié)構(gòu)基序，Bcl-2家族成員通過該結(jié)構(gòu)域識(shí)別并雙重調(diào)節(jié)凋亡和自噬分子［11，17］，抗凋亡蛋白Bcl-2與自噬蛋白Beclin-1 的相互作用是研究細(xì)胞凋亡與自噬機(jī)制的潛在靶點(diǎn)。

本研究采用Bcl-2、Beclin-1 作為標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)牡荊苷對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，藥物組Bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量降低，說明牡荊苷可能在基因水平調(diào)控細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；牡荊苷作用后腫瘤細(xì)胞Beclin-1 基因相對(duì)表達(dá)量升高，提示Beclin-1 基因可能通過參與自噬，加速了細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。通過Western Blot 法檢測(cè)細(xì)胞中Bcl-2、Beclin-1 蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)藥物組卵巢癌細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá)量降低，Beclin-1 蛋白表達(dá)量升高，說明牡荊苷在蛋白質(zhì)水平同樣影響了卵巢癌細(xì)胞的增殖活性，加速了腫瘤細(xì)胞的凋亡。可見，Bcl-2/Beclin-1 復(fù)合物可能是一個(gè)變阻器，通過調(diào)節(jié)Bcl-2 與Beclin-1 的相互作用，不僅控制細(xì)胞自噬水平，而且控制自噬基因依賴性細(xì)胞死亡。

綜上所述，本研究結(jié)果支持憂遁草黃酮苷提取物牡荊苷具有抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖的作用，通過降低Bcl-2 基因和蛋白的表達(dá)，升高Beclin-1 基因和蛋白的表達(dá)來控制細(xì)胞自噬，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，達(dá)到抑制腫瘤發(fā)展的作用。提示抗凋亡蛋白Bcl-2 與自噬蛋白Beclin-1 的相互作用是上皮性卵巢癌治療的潛在靶點(diǎn)，為開發(fā)憂遁草抗腫瘤藥用價(jià)值提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突