MLST方法用于支氣管鏡檢查治療室院內感染調查研究*

楊玉琪，周 磊，賀文芳，楊佩紅，張云玲，王美珠，周 柯△，劉家云▲

空軍軍醫大學第一附屬醫院：1.檢驗科； 2.疾病預防控制科，陜西西安710032

下呼吸道感染的診斷與治療除需要影像學支持外，還需要病原學支持，目前臨床常采用無創性痰液檢測方法獲取病原學依據。然而，因上呼吸道存在大量定植菌，如草綠色鏈球菌、表皮葡萄球菌、不動桿菌及念珠菌等，從而會對臨床診斷及治療造成干擾[1]。有研究表明，相對于常規痰液培養，通過支氣管鏡灌洗獲取的下呼吸道深部標本，可以有效避免上呼吸道定植菌的干擾，肺泡灌洗液中分離出的細菌，可以更明確地為臨床診斷提供依據，對臨床治療也更具有指導意義[2]。但值得注意的是，支氣管鏡是一種有可能為患者帶來一定損傷的侵入性操作，而且也因其具有結構復雜、材料特殊、管腔清洗具有死角等特點，可能會發生清洗、消毒不徹底，從而導致醫源性感染傳播的情況[3-4]。本研究在持續監測本院肺泡灌洗液培養結果時發現，2次肺泡灌洗液肺炎克雷伯菌(KP)集中被檢出，通過分析患者基本情況、菌株抗菌藥物藥敏試驗結果及應用多位點序列分型(MLST)方法對菌株進行分型分析，以期根據菌株間是否具有同源性發現其傳播流行規律，從而為可疑院內感染發生提供有效的判斷和預防控制依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共收集KP菌株23株，其中第一批(2020年3月25日至3月28日)11株分離自肺泡灌洗液標本，編號為1～11；第2批(2020年8月29日至9月2日)11株分離自肺泡灌洗液標本，編號為21～31，第2批還有1株分離自1號支氣管鏡管腔內。

1.2 儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統、GN細菌鑒定卡片、AST-GN13細菌藥敏卡片；Mueller-Hinton培養基；K-B藥敏紙片擴散法所用藥敏紙片；Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR所用試劑；Beckman DU800核酸蛋白分析儀；ABI 2720 PCR擴增儀；DNA凝膠電泳系統；凝膠電泳成像系統。

1.3 質控菌株 肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706、大腸埃希菌ATCC 25922均購自中華人民共和國國家衛生健康委員會臨床檢驗中心。

1.4 方法

1.4.1 抗菌藥物藥敏試驗 常規培養分離細菌，按照《全國臨床檢驗操作規程》進行操作；采用VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統進行細菌鑒定和藥敏試驗，采用K-B藥敏紙片擴散法進行藥敏試驗復核(亞胺培南和美羅培南)及其他補充藥物的藥敏試驗，結果判斷參照美國臨床和實驗室標準協會2020年標準執行。

1.4.2 細菌DNA提取 采用QIAamp DNA純化試劑盒對分離純化得到的對數生長期單菌落進行細菌DNA提取，并用Beckman DU800核酸蛋白分析儀檢測DNA純度和濃度，確保提取的DNA質量。

1.4.3 MLST方法 參照pasteur數據庫推薦的引物，選取7個獨立管家基因構建肺炎克雷伯菌MLST研究方案，分別為rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB[5]，引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。將提取的細菌DNA進行PCR擴增，PCR反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR產物經過1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定為單一條帶后，送上海生工生物工程股份有限公司測序，采用BioEdit軟件對測序結果進行校正、拼接。將各管家基因拼接后的結果在pasteur數據庫進行比對分析，從而獲得所對應的7個管家基因的等位基因型，進一步將其組合可獲得菌株ST型別。

1.4.4 內鏡清洗消毒效果監測 依據《醫院消毒衛生標準：GB 15982-2012》[6]進行采樣并檢測。支氣管鏡采樣部位為內腔面，取清洗消毒后的支氣管鏡，用無菌注射器抽取50 mL含相應中和劑的洗脫液，從活檢口注入沖洗內鏡管路，全量收集后2 h內送檢。取充分混合后的洗脫液1 mL接種平皿，清潔用水、在用消毒液使用中和劑中和后，接種方法相同。再取15～20 mL冷卻至40～45 ℃的營養瓊脂培養基傾注入平皿中，冷卻凝固后置于37 ℃孵箱中培養，48 h后進行觀察。

2 結 果

2.1 藥敏試驗結果 2次集中分離的23株KP對青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類和碳青霉烯類等抗菌藥物均敏感，且具有相同的耐藥表型。23株KP對各抗菌藥物敏感結果見表1。

表1 KP對21種抗菌藥物的敏感結果

2.2 KP的MLST結果 23株KP經過MLST后共得到10種ST型別。第1批分離的11株KP以ST23型為主(5株)，其余6株分別為ST374、ST1265、ST2159、ST347、ST65、ST86；第2批分離出的12株KP以ST375為主(10株)，其余2株分別為ST268、ST412；各管家基因序列及各ST型別分離菌株數見表2。

表2 KP的MLST結果

2.3 資料分析 22例患者初步診斷以可疑肺炎、肺部占位待查、肺結核待查為主，其中男12例，女10例，未見明顯性別差異；年齡29～69歲，平均(53.1±11.2)歲。本院支氣管鏡檢查治療室目前在用的支氣管鏡共4個，分別編為1～4號，其中第1批11株KP菌株在使用了4個支氣管鏡的患者肺泡灌洗液中分別檢出，以ST23型為主，共5株(45.5%,5/11)，且該5例患者均使用的是2號支氣管鏡；第2批11株KP除2株分離自2例使用了2號、3號支氣管鏡的患者肺泡灌洗液中，其余9例均分離自使用了1號支氣管鏡的患者肺泡灌洗液中，且均為ST375型(81.8%,9/11)；第2批采樣的1號支氣管鏡管腔內也分離出ST375型KP。22例患者肺泡灌洗液分離KP 菌株ST型別及其使用支氣管鏡編號情況見表3。

表3 KP菌株ST型別分離情況

3 討 論

隨著現代醫學技術的不斷發展，各種內鏡診療技術在臨床的應用逐漸普遍化，隨之帶來的因內鏡下檢查與治療所致的感染也時有報道[7-8]。做好內鏡清洗、消毒工作，在預防和控制患者醫院獲得性感染中起至關重要的作用,防止交叉感染將成為21 世紀內鏡檢查面臨的重大問題[9]。

肺泡灌洗液是通過將纖維支氣管鏡插入氣道，使用無菌生理鹽水反復灌洗病變部位后，回收到的肺泡表面襯液[10]，其用于病原微生物學檢查，可有效避免上呼吸道定植菌群污染，從而能有效分離并確定感染病原菌，對合理選擇用藥方案有積極的指導意義[11]。本研究2次集中分離的23株KP其菌落均有高黏性特征，并且對所做的21種抗菌藥物均呈高度敏感性，所以單從菌落特征和藥敏試驗表型來看，并不能區分其是否具有相關性及同源性。MLST用作細菌分型，通過對菌株ST型別及親緣關系進行分析，可以判斷菌株間的同源性，其作為暴發流行的溯源工具，具有較高的準確性和分辨率，且可重復性好[12-13]。本研究針對2次集中分離出的23株KP采用MLST方法進行型別分析，以期發現其是否具有同源性。MLST結果顯示，第1批分離出的11株KP，其中有5株(45.5%)均為ST23型，短期內發現同一ST型別KP的高比率檢出，且該5例患者使用的均是同一個支氣管鏡(2號支氣管鏡)，提示可能存在器械性檢查操作所造成的院內感染。然而遺憾的是，同時對在用的4個支氣管鏡的各段管腔、清潔用水、在用消毒液分別進行采樣培養，均未從中分離出KP。支氣管鏡因管腔內部結構的影響，采樣難度高，從而造成監測結果有假陰性的可能，然而集中分離出同一型別同一菌株的情況，應引起院內感染監測的重視。持續觀察期間，第2批分離出的12株KP(包括1號支氣管鏡管腔)，其中使用了1號支氣管鏡的9例患者分離出的KP菌株均為ST375型(81.8%)，且該次同時對在用的4個支氣管鏡的各段管腔、清潔用水、在用消毒液分別進行了采樣培養和調查分析，從1號支氣管鏡管腔內分離出的KP菌株為ST375型，可以看出其具有同源相關性，提示確實存在器械性檢查操作所造成的院內感染。對2次集中病例進行初步診斷可以看出，2次集中從肺泡灌洗液中分離的KP，首例患者均初步診斷為肺炎，考慮其肺部存在KP感染，可能造成檢查過程中對支氣管鏡的污染，從而導致器械性檢查操作所造成的其他患者發生院內感染。KP作為一種可以定植于人體呼吸道和消化道的條件致病菌，會在機體抵抗力下降時引發肺部感染、血流感染等。據報道，KP引起的社區獲得性和醫院獲得性感染逐年增加，而近幾年關于KP引起的醫院獲得性感染的增加主要與各種器械性操作和創傷性診療技術增多有關[14]。

針對此次疑似支氣管鏡院內感染的發生，醫院感染專職人員和微生物室進行共同采樣及檢測，并在采樣的同時對支氣管鏡清洗、消毒的方式和流程，以及所使用的清洗消毒液種類和清洗消毒時間等也進行了調查監測。流行病學調查結果顯示，本院對支氣管鏡不耐熱部位的消毒采用的是高水平消毒液鄰苯二甲醛，懷疑使用該消毒液對支氣管鏡管腔進行浸泡時發生了消毒效果不良事件。鄰苯二甲醛作為一種用于處理不耐熱醫療器械的高水平消毒液，使用時應將器械完全浸入20 ℃以上的鄰苯二甲醛消毒液最少5 min，灌滿所有管腔并排除氣泡，以消滅所有致病微生物。在消毒之前，必須完全清洗污染的可重復使用的器械，因為殘留的含有污漬或潤滑油的污染物會降低消毒劑的有效性；每次使用前應使用鄰苯二甲醛消毒液濃度測試試紙確認鄰苯二甲醛的濃度應符合要求(有效消毒濃度應不低于0.3%)；同時，使用期間建議使用溫度計和定時器確保符合最佳條件[15]。支氣管鏡消毒合格率要達到100%具有一定的難度，支氣管鏡使用后，及時、徹底、規范清洗，可有效阻止生物膜形成，是保證支氣管鏡消毒成功的關鍵和基礎[7]。提高清洗、消毒工作人員的操作規范性，加強支氣管鏡清洗、消毒效果監測，同時結合分子分型方法等檢測手段，可以確保支氣管鏡等內鏡的消毒質量，從而有效降低或阻止院內感染發生。