一類21種HPV亞型檢測試劑盒的性能驗證和評價*

馮倚帆，張 帥，劉志堅，宋子威，熊曉蕓

1.徐州醫科大學附屬醫院檢驗科，江蘇徐州 221002；2.江蘇省疾病預防控制中心，江蘇南京 210009

人乳頭瘤病毒(HPV)感染日益引起公眾的關注，PATEL等[1]基于對全世界32項研究的系統回顧分析發現，每年肛門-生殖器疣的發病人數為每10萬人就有160～289例。低危型HPV感染導致皮膚或黏膜疣狀突起，比如HPV6、11型易導致尖銳濕疣。有研究發現，美國每年有1 400 萬人確診感染HPV，意味著HPV的流行范圍接近8 000萬人。HPV某些高危型長期和反復感染是導致惡變(包括宮頸癌、陰莖癌、肛門癌、陰道癌、外陰癌等)最主要的因素[2]。有研究發現，25%的頭頸鱗狀細胞癌與HPV感染有關[3]，60%的口腔鱗狀細胞癌主要原因是HPV16型長期感染[4]。而絕大多數宮頸癌病例均由HPV感染引起，中國約占全球宮頸癌的1/3，中國2015年新增宮頸癌病例約98 900例[5]。依據《醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明：CNAS-CL02-A009：2018》[6]和《醫療機構臨床實驗室管理辦法》[7]在基因擴增檢驗領域的應用說明，新試劑在實驗室應用于臨床檢驗前要進行性能驗證，才能保證實驗室對該項目檢測的質量控制。徐州醫科大學附屬醫院檢驗科微生物室新購的人乳頭瘤病毒核酸分型檢測試劑盒[江蘇碩世生物科技股份有限公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)]可檢測21種HPV亞型。為確定本實驗室新啟用試劑能達到試劑說明書上聲明的性能指標，滿足臨床檢測要求，保證檢測質量，本研究對21種HPV亞型檢測試劑盒的準確度、最低檢測限、精密度、特異度及抗干擾能力等性能進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 江蘇碩世生物科技股份有限公司提供的24例標本，經亞能生物膜雜交法實驗驗證其中19例陽性(涵蓋該試劑盒可檢測的21種亞型)和5例陰性；江蘇碩世生物科技股份有限公司提供的陽性參考品，主要成分為HPV21種亞型及參考基因質粒；徐州醫科大學附屬醫院檢驗科微生物室、婦產科實驗室和皮膚科實驗室提供的白色念珠菌、大腸埃希菌及解脲支原體陽性標本，這些標本與HPV感染部位相同，癥狀相似，且不在該試劑盒檢測范圍內。

1.1.2 儀器與耗材 SLAN-96P熒光定量PCR分析儀(購自上海宏石醫療科技有限公司)；Eppendorf高速低溫離心機、Eppendorf金屬浴恒溫器、Eppendorf漩渦振蕩儀、八聯管(A～H)均購自美國Axygen公司。

1.1.3 試劑 來自江蘇碩世生物科技股份有限公司的核酸提取與純化試劑盒、人乳頭瘤病毒核酸分型檢測試劑盒(熒光定量PCR)，可檢測21種HPV亞型，包括高危型HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82、73型及低危型HPV6、11、81型。

1.2 方法

1.2.1 提取HPV核酸 取出標本，振蕩混勻，吸取500 μL標本于帶螺口的離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，保留沉淀物。加入100 μL宮頸細胞標本裂解液，振蕩混勻，100 ℃水浴或干浴10 min。振蕩混勻，12 000 r/min離心5 min，上清液即為核酸溶液，加入反應試劑就可直接用于檢測。

1.2.2 PCR 擴增參數：50 ℃ 5 min 尿嘧啶-N-糖基化酶處理；95 ℃ 5 min預變性；95 ℃ 10 s變性，58 ℃ 40 s退火、延伸及檢測熒光，其中58 ℃時熒光檢測的檢測通道為FAM、VIC、ROX 3種熒光反應，45個循環；儀器冷卻。PCR擴增結果分析：反應結束儀器可自動保存結果。空白對照無典型S型擴增曲線顯示；陽性對照HPV21種亞型及參考基因檢測呈典型S型擴增曲線，且Ct值≤30.0；參考基因H孔FAM通道擴增曲線呈典型S型曲線，且Ct值≤36.7。

1.2.3 性能驗證指標及驗證方法 (1 )準確度驗證。亞能生物膜雜交法試驗已檢測的24例標本(陽性19例和陰性5例)，嚴格按照HPV核酸提取和擴增程序進行試驗。將測定結果與已知結果進行比對，若檢測結果不一致，需采用金標準測序法進行驗證，符合率≥95%為合格。(2)最低檢測限。最低檢測限的驗證選擇該試劑公司的企業陽性參照物(濃度為107copy/mL)，進行10倍梯度倍比稀釋至試劑盒提供的最低檢測限為104copy/mL，重復檢測20次。檢測結果陽性率≥95%為合格。(3)精密度試驗。選擇該試劑公司的企業陽性參照物。批內CV：在一個批次內連續檢測做10個重復管，并計算Ct值的CV，參考《核酸擴增檢測用試劑(盒)：YY/T1182-2010》[8]，計算其CV≤5.00%為合格。批間CV：連續檢測5 d，每天重復4次，并計算Ct值的CV，參考文獻[9]計算其CV<5.00%為合格。(4 )特異度。采用該試劑盒檢測與HPV感染部位相同、癥狀相似的病原體及該試劑盒檢測范圍之外的物質，白色念珠菌、大腸埃希菌和解脲支原體分別加入標本中，以陰性標本作為對照，按照核酸提取和擴增程序進行檢測。檢測結果顯示交叉反應陰性為合格。(5) 抗干擾能力。將標本(HPV16型/HPV31型)均等分為5份，編號1～5，1號加入與干擾物質等體積的TE緩沖液作為對照組，2～5號分別加入檢測標本中常見的干擾物[宮頸黏液、血紅蛋白、白細胞、陰道潤滑油(5%)]作為試驗組。按照核酸提取和擴增程序進行檢測，檢測結果為HPV16、31型檢出為驗證合格。

2 結 果

2.1 HPV亞型檢測試劑盒準確度驗證結果 24例標本中19例陽性標本試驗結果與已知結果均一致，符合率為100.00%，見表1。

表1 HPV分型檢測試劑盒準確度驗證結果

2.2 最低檢測限 該試劑盒的最低檢測限為104copy/mL，陰性率為100.00%，符合試劑盒聲明的最低檢測限，最低檢測限驗證合格。

2.3 精密度 21種HPV亞型和陽性參照物批內CV為0.22%～3.40%，CV均小于5.00%，符合行業標準(CV≤5.00%)；21種HPV亞型和陽性參照物批間CV為0.31%～0.91%，CV均小于5.00%，符合行業標準(CV<5.00%)，精密度驗證合格。

2.4 特異度 該試劑盒與白色念珠菌、大腸埃希菌和解脲支原體不存在交叉反應，與試劑盒說明書聲明一致，特異度驗證合格。

2.5 抗干擾能力 已知陽性標本分別加入干擾物(宮頸黏液、血紅蛋白、白細胞、陰道潤滑油)后，均檢出HPV16、31型，檢測結果及參考基因Ct值的CV為0.11%～0.32%，抗干擾能力驗證合格。

3 討 論

HPV DNA載量通常估計為每個細胞的HPV基因組拷貝數，與HPV感染疾病有很大程度的相關性，并且在區分正常細胞學和異常細胞學方面具有特異性[10]。目前，針對HPV的檢測方法主要有核酸分型定性檢測、HPV-原位雜交、雜交捕獲HPV DNA檢測、細胞學檢測、病理組織學檢測等，可用于檢測高危和低危的HPV亞型[11]。而現階段有些 HPV分型檢測試劑采用生物膜雜交法，該方法不僅操作步驟煩瑣，而且容易污染環境。雜交法試劑在檢測 HPV時，其靈敏度低于其他PCR擴增檢測試劑，存在一定比例的漏檢[12]。而采用多重熒光定量PCR，整個檢測過程自動化程度高、操作簡便，而且能最大限度避免擴增產物引起的環境污染，具有檢測原理簡單，易取材且取材量少，報告時效較短，以及收費合理等優勢。因此，多重熒光定量PCR用于診斷HPV感染，對細胞異常人群的風險分層、促進患者管理有很重要意義[13]。

江蘇碩世生物科技股份有限公司的HPV試劑盒在儀器正常，以及空白對照、陽性對照、八聯管H孔FAM通道均正常的情況下，核酸擴增根據HPV亞型探針熒光標記進行分析。根據參考值(參考范圍)在8個樣本孔(A～H孔)中的HPV亞型擴增曲線呈典型S型曲線，且Ct值小于或等于參考值，判斷相應的 HPV亞型為陽性；無典型S型擴增曲線或Ct值大于參考值，則判斷相應的HPV亞型為陰性。準確度、最低檢測限、精密度和特異度驗證擴增曲線均有效，驗證結果為合格。在驗證抗干擾能力時，出現一條異常曲線，原因是該八聯管上機擴增前掌上離心機損壞，未離心的八聯管內有氣泡，擴增時出現異常曲線，但其他擴增曲線沒有受到干擾，驗證結果合格是有效的。

該試劑盒以HPV基因組L1區為靶區域，設計21對各亞型特異性引物和21條特異探針，分別以FAM、HEX、ROX標記相應亞型的探針。探針為包括5′端報告基團和3′端淬滅基團的寡核苷酸，在PCR擴增過程中，當探針完整時，由于淬滅基團靠近報告基團，報告基團發出的熒光被淬滅基團吸收，不發出熒光信號。引物延伸時，與模板結合的探針被Taq酶(5′→3′外切核酸酶)切斷，報告基團與淬滅基團分離，產生熒光信號，熒光定量PCR儀根據檢測到的熒光信號自動繪制出實時擴增曲線，從而實現對HPV在核酸水平上的定性檢測。多重熒光PCR技術與八聯管空間分隔技術相結合，在反應中每個PCR反應孔內僅包含3對不同亞型的特異性引物及其相應的3條分別以FAM、HEX、ROX熒光標記的特異探針，檢測3個通道即可分析出具體亞型，故HPV不同亞型之間不可能存在交叉反應。 這種檢測原理的試劑盒通過多個反應孔實現多種亞型的分型，特異性引物PCR 的優勢在于能夠保證高靈敏度和高特異度地鑒定單一亞型，有利于在多重感染中檢出不同 HPV亞型。

此外，《人乳頭瘤病毒(HPV)核酸檢測及基因分型試劑技術審查指導原則》[14]中提到干擾物質的選取應至少包括血紅蛋白、白細胞、宮頸黏液、陰道避孕藥物、女性衛生用品、陰道用抗真菌藥物、陰道潤滑劑等。本次性能驗證選擇常規檢測標本中常見的干擾物包括宮頸黏液、血紅蛋白、白細胞、陰道潤滑油。在月經期一般不建議做HPV核酸檢測，故本次試驗未選擇女性衛生用品。陰道避孕藥物和陰道用抗真菌藥物一般需要在陰道環境中作用一段時間，使有效成分釋放，考慮到很難做到較真實的臨床模擬，故未選擇。

該試劑盒可一次性檢出21種HPV亞型，包括常見的18種高危型和3種低危型，涵蓋了常見的引起不良轉歸的亞型。檢測過程比較簡單、高效，同時也不能忽視其可能存在的問題。由于該試劑盒采用八聯管空間分隔技術，導致檢測通量相對較低。對于大批量篩查需要多臺實時熒光定量PCR儀。另外，PCR檢測技術也可能由于受DNA提取、樣品類型和檢測方法局限的影響，甚至存在攜帶污染、擴增產物污染等造成的假陽性、假陰性。在檢測過程中，若存在標本采樣、運輸、保存條件及實驗操作不當等可導致參考基因擴增曲線異常，則該次試驗定性結果為無效。嚴格按照試劑說明書及實驗室標準操作程序進行操作，可最大限度避免無效結果出現。

綜上所述，本研究整個性能驗證過程均處于有效的質量控制下，做到最大限度保證數據的準確性及可重復性，性能驗證符合行業標準需求，這份HPV亞型檢測試劑盒(熒光定量PCR)可在本實驗室進行臨床檢驗相關診斷。