食品中單核細胞增生李斯特菌株生物被膜形成、藥敏試驗及毒力基因檢測

何 梅

安徽省宣城市疾控中心檢驗科，安徽宣城 242000

單核細胞增生李斯特菌是現階段臨床中較為常見的病原菌，也是重要且常見的食源性人畜共患菌[1]。有研究將單核細胞增生李斯特菌與沙門菌、出血性大腸埃希菌、志賀菌共列為四大重要食源性致病菌[2]。人類李斯特菌病約85%以上主要由單核細胞增生李斯特菌感染引起，并且對老人、新生兒、免疫功能低下者等造成主要威脅，近年來受感染人群病死率居高不下。有研究指出，機體在感染單核細胞增生李斯特菌后會穿過機體三大免疫障礙，導致腦膜炎、胃腸炎、流產、敗血癥[3]。有研究指出，2～42 ℃條件下李斯特菌均可有效生長，對營養(yǎng)需求和要求不高，形成生物被膜，并且可在食品中持續(xù)存在，也是臨床中導致人類李斯特菌病的主要病原菌[4]。有研究指出，生物被膜與80%以上人類細菌性感染密切相關，生物被膜指細菌黏附于非生物或生物表面，分泌并釋放大量纖維蛋白、多糖基質、脂質蛋白等，將自身包繞在生物被膜內，并形成大量細菌胞外聚合物[5]。在陰暗、潮濕食品加工生產環(huán)境中，以及機械管道和表面廣泛存在，單核細胞增生李斯特菌形成包括細菌可逆和不可逆黏附、初始附著表面、微菌落形成、成熟和脫離過程[6]。有研究指出，單核細胞增生李斯特菌生物被膜具有特殊立體多層結構，導致消毒劑或抗微生物藥物無法達到內層細菌，誘發(fā)耐藥性，使其無法有效抑菌、殺菌[4]。因此，有效分析食品中單核細胞增生李斯特菌株生物被膜形成、藥敏試驗有十分重要的意義。本研究擬選取宣城地區(qū)檢測的食品中分離的單核細胞增生李斯特菌株作為研究對象，分析生物被膜形成、藥敏試驗及毒力基因檢測結果，為臨床防治提供依據。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 本研究所用菌株均為分離于宣城地區(qū)各類檢測食品的102株單核細胞增生李斯特菌，以沙門菌H9812和金黃色葡萄球菌 ATCC25923作為PFGE參考菌株和藥敏質控菌株，所有菌株均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 生物被膜檢測 本研究考察不同溫度、培養(yǎng)基濃度、培養(yǎng)時間、pH值、NaCl濃度、葡萄糖濃度對生物被膜形成的影響，其中考察的不同溫度分別為19、28、37、46 ℃，不同培養(yǎng)基濃度分別為25%、50%、75%、100% BHI培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)時間分別為6、12、24、48、72 h，不同pH值分別為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，不同NaCl濃度分別為5 、15 、25、35 、45 g/L，不同葡萄糖濃度分別為2、12、22、32、42 g/L。采用微孔板定量法對生物被膜形成進行測定，在96孔細胞培養(yǎng)板中加入1∶100稀釋菌液，每孔加入200 μL，設8個復孔，蓋好蓋子封口，后將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，后將各孔中培養(yǎng)基吸出，生理鹽水漂洗3次，除去未形成生物被膜的浮游菌體，干燥后加入甲醇200 μL，固定30 min后吸除，并使用生理鹽水漂洗3次，待干后加入1%草酸銨結晶紫溶液200 μL，染色20 min后吸除溶液，使用生理鹽水漂洗4次，干燥后加入95%乙醇200 μL，振蕩脫色20 min，充分脫色后以無菌培養(yǎng)基作為空白對照，并用酶標儀對生物被膜562 nm的吸光度值進行測定，所有試驗均進行3次重復檢測，取均值。

1.2.2 藥敏試驗 本研究采用微量肉湯稀釋法對食品中的單核細胞增生李斯特菌株進行藥敏試驗，監(jiān)測青霉素、氨芐西林、復方磺胺甲噁唑、美羅培南、環(huán)丙沙星、紅霉素、四環(huán)素、萬古霉素8種抗菌藥物。以金黃色葡萄球菌ATCC 25923作為藥敏質控菌株，參照EUCAST標準和美國臨床和實驗室標準協(xié)會標準對藥敏試驗結果進行判斷和評估。

1.2.3 毒力基因檢測 采用PCR對毒力基因進行檢測，提取單核細胞增生李斯特菌株DNA模版，并參照Premix Taq試劑盒說明書進行PCR操作和檢測，反應體系共25 μL，12.5 μL Premix Taq預混液，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，2 μL模板，其余使用ddH2O。反應條件：預變性5 min(94 ℃)、變性30 s(94 ℃)、退火30 s(52 ℃)、延伸60 s(72 ℃)，循環(huán)35次，延伸10 min(72 ℃)，使用毛細管電泳儀對結果進行檢測并觀察結果。上、下游引物見表1。

表1 上、下游引物

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數據分析處理。計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同條件生物被膜形成檢測結果 隨著培養(yǎng)時間的延長及BHI培養(yǎng)基濃度升高，生物被膜形成率呈明顯升高趨勢，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。pH值為7.5、NaCl濃度為5 g/L、葡萄糖濃度為22 g/L、溫度為37 ℃時生物被膜形成率最高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同條件生物被膜形成檢測結果

2.2 單核細胞增生李斯特菌藥敏試驗結果 單核細胞增生李斯特菌對氨芐西林、美羅培南、青霉素及萬古霉素的敏感率均為100.00%，而對復方磺胺甲噁唑、環(huán)丙沙星、紅霉素、四環(huán)素則表現出不同的耐藥性，其中對四環(huán)素耐藥率最高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 單核細胞增生李斯特菌藥敏試驗結果[ n(%),n=102]

2.3 單核細胞增生李斯特菌毒力基因檢測結果 單核細胞增生李斯特菌毒力基因iap和inlA陽性率均為100.00%，而prfA、hlyA、plcB陽性率均不足100.00%，其中plcB陽性率最低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 單核細胞增生李斯特菌毒力基因檢測結果(n=102)

3 討 論

近年來，我國各地對食品開展單核細胞增生李斯特菌株污染和檢測狀況調查結果顯示，熟肉類、生肉類、水產品類、家禽類、乳制品類及蔬菜類等多種食品中均可能檢出單核細胞增生李斯特菌[7]。許多地區(qū)單核細胞增生李斯特菌株污染調查結果顯示，生鮮肉類食品是污染率較高的食品[6]。進食出現單核細胞增生李斯特菌株污染的食品是臨床中導致人感染單核細胞增生李斯特菌的主要因素。生物被膜是細菌的一種自然生命現象，當出現生物被膜后會使細菌適應自然環(huán)境，增強對環(huán)境不利因素的適應能力和耐受度，降低堿、酸等的細菌清除能力[8]。有研究指出，生物被膜的形成是一個動態(tài)過程，其形成能力也是影響耐藥性和致病性的關鍵因素之一[9]。

單核細胞增生李斯特菌有較高的形成生物被膜的能力，體外研究結果顯示，單核細胞增生李斯特菌生物被膜是一種呈網狀結構的高度組織化聚合物，細菌被緊緊包裹在生物被膜中，細菌不僅可有效獲取外界營養(yǎng)，還可有效對抗外界不利因素，因此，形成生物被膜使單核細胞增生李斯特菌致病性及耐藥性均較高[10]。不同溫度條件下，生物被膜形成能力存在明顯差異，相對于37 ℃，在BHI培養(yǎng)基溫度為25 ℃時單核細胞增生李斯特菌的生物被膜形成能力明顯降低[11]。不同營養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)溫度均會對生物被膜形成能力造成不同程度的影響，其中金黃色葡萄球菌可在胰酶大豆肉湯、37 ℃條件下大量形成生物被膜[12]。在低pH環(huán)境條件下，細菌可通過壓力生存機制產生一系列重要的抗酸反應，以對外界酸環(huán)境進行抵抗。有研究發(fā)現，變形鏈球菌在低濃度蔗糖和棉子糖條件下可通過協(xié)同作用誘導生物被膜形成，并且可在人體牙齒表面聚集，誘導產生齲齒[13]。有研究發(fā)現，通過將低濃度的葡萄糖添加到培養(yǎng)基中可有效促進蠟樣芽孢桿菌形成生物被膜，而當提高葡萄糖濃度則會明顯抑制蠟樣芽孢桿菌生物被膜的生長[14]。

糖類等多種碳源營養(yǎng)物質可促使細菌分泌纖維蛋白、多糖基質等胞外聚合物，有利于細菌繁殖生長，形成致密生物被膜。一定濃度的糖可增加細菌間黏附力，使生物被膜形成并聚集而難以脫落，其可能增加細胞表面疏水性，增強微生物附著和黏附。高濃度葡萄糖環(huán)境中滲透壓加大細菌生存壓力，降低生物被膜形成量。本研究結果顯示，培養(yǎng)24 h后單核細胞增生李斯特菌會出現致密生物被膜，連成網狀結構，且隨著培養(yǎng)時間延長，生物被膜呈一定聚集疊加狀態(tài)，形成復雜的團狀結構。進一步分析顯示，100% BHI 培養(yǎng)基濃度、37 ℃、22 g/L葡萄糖濃度、5 g/L NaCl濃度、pH 值為7.5是形成單核細胞增生李斯特菌生物被膜的最適條件。本研究結果提示，在食品加工過程中應盡可能避免出現上述條件，降低生物被膜形成概率，減少微生物殘留。因此，在工作中應盡可能保持較低的環(huán)境溫度，縮短加工時間，使用堿性消毒液滅菌消毒，適當降低水分含量，增加滲透壓。此外，在實踐工作中還應嚴格沖洗加工環(huán)境、設備表面等，減少糖分和生物被膜殘留。

細菌耐藥問題是臨床中廣泛關注的焦點問題之一，也是現階段的研究熱點，已成為目前全球范圍內重大的公共安全問題。單核細胞增生李斯特菌是主要的食源性致病菌，近年來美國、加拿大、歐盟、日本等均逐漸建立細菌耐藥性監(jiān)測系統(tǒng)，密切監(jiān)測和記錄單核細胞增生李斯特菌的耐藥性。單核細胞增生李斯特菌對多種抗菌藥物均具有較高的敏感率。我國食源性疾病監(jiān)測網數據顯示，我國單核細胞增生李斯特菌主要對鹽酸多西環(huán)素、四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星耐藥，并且可能伴隨出現多重耐藥[15]。本研究結果顯示，宣城地區(qū)分離自食品的單核細胞增生李斯特菌對氨芐西林、萬古霉素、青霉素和美羅培南敏感率為100.00%，但對復方磺胺甲噁唑、紅霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星則出現不同程度的耐藥性，未出現多重耐藥。其中單核細胞增生李斯特菌對四環(huán)素的耐藥率最高，其可能與近年來動物飼料中出現四環(huán)素添加使用密切有關，因此，可能導致單核細胞增生李斯特菌對四環(huán)素的耐藥率較高。單核細胞增生李斯特菌的毒力基因與致病性密切相關，作為重要的胞內寄生菌，當單核細胞增生李斯特菌出現毒力基因缺失則會導致其致病性明顯降低，甚至可能消失。本研究結果顯示，大部分單核細胞增生李斯特菌株中均可檢出iap、inlA、plcB、prfA、hlyA毒力基因，表明宣城地區(qū)分離自食品的單核細胞增生李斯特菌多具有潛在致病力，少數單核細胞增生李斯特菌出現毒力基因丟失現象。

隨著培養(yǎng)時間的延長及BHI培養(yǎng)基濃度升高，單核細胞增生李斯特菌生物被膜形成率呈明顯升高趨勢，pH值為 7.5、NaCl濃度為 5 g/L、葡萄糖濃度為22 g/L、溫度為37 ℃時生物被膜形成率最高，單核細胞增生李斯特菌對四環(huán)素耐藥率最高，毒力基因plcB陽性率最低。本研究選擇的菌株數較少，另外檢驗手段較單一，結果可能會產生一定偏倚，有待后續(xù)進行持續(xù)研究追蹤。