4種不同核酸提取試劑在自建新型冠狀病毒核酸檢測系統中性能比較

黃裕游，何雪芳

廣東省汕尾市人民醫院檢驗科，廣東汕尾 516600

新型冠狀病毒核酸檢測是確診新型冠狀病毒肺炎的首要標準[1]，核酸提取作為實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)的預處理步驟，提取產物的質量對擴增結果有很大影響。根據《分子診斷檢驗程序性能驗證指南：CNAS-GL039:2019》[2]，提取試劑的驗證需要進行核酸純度、核酸提取產率及核酸完整性驗證。本研究因條件限制，采用一種間接方法，即使用已知濃度的驗證樣本用待評價提取試劑進行提取，然后進行擴增檢測，比較分析所得到的結果，從而對待評價試劑盒進行評價分析。

1 材料與方法

1.1 儀器 選用廣州和信生物科技有限公司提供的新型冠狀病毒室內質控品作為驗證樣本，該質控品由國家衛生健康委臨床檢驗中心研發，廣州和信生物科技有限公司生產，并通過數字 PCR技術對質控品進行定量，選用的標準物質為新型冠狀病毒核酸標準物質GBW(E)091090，檢測試劑使用上海之江生物科技股份有限公司的新型冠狀病毒核酸檢測試劑，待評價提取試劑盒為市面上4種品牌的磁珠法核酸提取試劑盒，包括上海之江生物科技股份有限公司(A)、重慶中元生物技術有限公司(B)、廣州和信生物科技有限公司(C)及杭州博日科技有限公司(D)。提取儀器使用提取試劑盒專用或廠家配制儀器，產物擴增使用杭州博日科技有限公司LineGene 9600 Plus熒光定量PCR儀。

1.2 判斷標準 根據檢測試劑說明書，靶基因熒光通道Ct值≤43，且擴增曲線呈典型S型，則判斷為靶基因陽性，結果判斷見表1。有研究證明，Ct值大小與樣本中的原始拷貝數呈反比[3]，Ct值越小可反映出提取液中靶基因模板濃度越高。

表1 擴增結果判斷

1.3 方法 根據《醫療機構新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊(試行第二版)》[4]要求，檢測試劑的檢出限為≤500 copy/mL，弱陽性質控為試劑檢測限的1.5～3.0倍，故本研究樣本最高濃度設定為文件要求弱陽性的最高濃度1 500 copy/mL，最低濃度設定為本研究使用的檢測試劑的檢出限為200 copy/mL，中間取1 000 copy/mL及500 copy/mL兩種濃度梯度。用去離子水對1 500 copy/mL的質控原液按一定比例稀釋至1 000、500、200 copy/mL，每種濃度梯度配置成5個樣本進行提取，再將每份提取產物平行進行3次擴增，得到15個擴增結果，最后將結果進行分析處理。

2 結 果

2.1 4種品牌在不同濃度樣本中檢測結果比較 按檢測試劑說明書檢測結果的判定方法對所有檢測結果進行判定，見表2。A品牌在500 copy/mL及200 copy/mL的樣本中均有可疑陽性結果；B品牌在500 copy/mL的樣本中出現可疑陽性結果；C品牌在各種濃度樣本中均有可疑陽性結果，在1 500 copy/mL及200 copy/mL的樣本中出現陰性結果；D品牌在各種濃度樣本中結果均為陽性。

表2 4種品牌在不同濃度樣本中檢測結果比較(%)

2.2 4種品牌在不同濃度樣本中基因檢出率比較 使用A、B、D品牌提取試劑提取核酸后擴增結果中，ORF1ab基因檢出率最高，均在93.33%以上；隨著樣本濃度降低，A、B、D 3個品牌總基因檢出率均有所下降，但均在80.00%以上；D品牌結果中，各靶基因漏檢不超過2個；C品牌結果中，不同靶基因漏檢率均較高，檢出率均小于或等于80.00%。見表3。

表3 不同提取試劑提取不同濃度樣本基因檢出率比較(%)

續表3 不同提取試劑提取不同濃度樣本基因檢出率比較(%)

2.3 擴增結果Ct值比較 A、B、D品牌在1 500 copy/mL濃度樣本中基因檢出率均為100.00%，故選取此濃度樣本的擴增結果進行Ct值分析。A、B、D品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后ORF1ab基因擴增結果Ct值比較，差異有統計學意義(F=22.29，P<0.05)；A品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后ORF1ab基因擴增結果Ct值均大于B、D品牌，差異均有統計學意義(P<0.05)；C品牌各濃度樣本均存在靶基因漏檢，故不列入比較；B品牌批內重復性最佳(CV最小)。見表4。 A、B、D品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后N基因擴增結果Ct值比較，差異有統計學意義(F=3.73，P<0.05)； A品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后N基因擴增結果Ct值大于B品牌，差異有統計學意義(P<0.05)；D品牌批內重復性最佳(CV最小)。見表5。A品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后E基因擴增結果Ct值大于D品牌，D品牌大于B品牌，D品牌與A、B品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后E基因擴增結果Ct值比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；D品牌批內重復性最佳(CV最小)。見表6。

表4 A、B、D品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后ORF1ab基因擴增結果Ct值比較

表5 A、B、D品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后N基因擴增結果Ct值比較

表6 A、B、D品牌提取1 500 copy/mL濃度樣本后E基因擴增結果Ct值比較

3 討 論

自2019年新型冠狀病毒肺炎疫情暴發以來，國內疫情已基本得到控制，但由于全球疫情的肆虐，國內疫情防控依然嚴峻。2021年來，廣州、南京、張家界、鄭州等地仍出現小規模疫情暴發，而大規模人群核酸篩查在疫情防控中起非常重要的作用。RT-PCR目前作為新型冠狀病毒核酸檢測的常規檢測手段之一，是靈敏度和特異度平衡較好的檢測技術[5]。核酸的提取與純化是RT-PCR的關鍵步驟之一，不同核酸提取方法提取質量有一定差異。吳永彬等[6]研究結果顯示，磁珠法較裂解法和柱提法有更好的性能；楊超杰等[7]研究發現，手工過柱提取法耗時較長，無法有效節約時間和人力成本，不推薦用于大規模樣本的篩查；張云麗等[8]研究顯示，免提取樣本釋放劑得到的結果重復性不如磁珠法好。磁珠法是近年來比較常用的核酸提取方法，具有簡便、高效、提取濃度及純度較高等優勢[9]，而且可以配套全自動提取儀實現自動化提取，極大地節約了時間及人力成本。

馬雯等[10]通過不同濃度的驗證樣本，對市面上4種核酸提取試劑進行性能驗證，研究不同提取試劑盒提取的核酸產物對擴增結果的影響。本研究結果顯示，A、B、D品牌的提取試劑提取濃度較高的樣本，雖然擴增結果的Ct值有一定差異，但對結果判斷的影響相對較小，不會出現可疑或陰性結果，而在濃度較低的樣本中，雖出現漏檢率，但依然沒有出現陰性結果，在實際工作中，通過復查即可得出陽性結果。在1 500 copy/mL濃度樣本的Ct值比較中，B品牌各靶標Ct值總體上低于A品牌，可認為B品牌提取產物濃度較A品牌要高，提取產物濃度越高，靶基因的檢出率就越高，這也是B品牌在低濃度樣本靶基因檢出率高于A品牌的原因；B品牌與D品牌中ORF1ab及N基因的Ct值差異無統計學意義(P>0.05)，但D品牌結果的CV總體上要小于B品牌，使低濃度樣本中D品牌檢出率更高，結果更穩定。C品牌的結果漏檢率非常大，在高、低濃度樣本中均有陰性結果出現，低濃度樣本檢出率高于高濃度樣本，可能是由于C品牌的提取試劑盒提取后的核酸模板并不適合使用上海之江生物科技股份有限公司檢測試劑進行擴增，使多數擴增結果落在灰區從而影響靶基因檢出率。國內有研究顯示，不同提取試劑與新型冠狀病毒核酸檢測試劑搭配使用，其結果存在差異，實驗室應選擇合適提取試劑和檢測試劑搭配使用[10-13]。

《醫療機構新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊(試行第二版)》[4]中提到，應選用擴增檢測試劑盒指定的核酸提取試劑和擴增儀。而在現實工作中，由于許多基層實驗室自身條件的限制，無法全部實現使用指定的檢測系統，這就使實驗室使用自建檢測系統用于臨床樣本檢測前，對于由提取試劑、提取儀、擴增試劑、擴增儀等組成檢測系統進行系列性能驗證顯得十分必要。