左歸丸對早發性卵巢功能不全大鼠卵巢組織Notch信號通路的影響

張兆萍， 曾麗華， 梁蘊儀， 朱玲

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405）

發生于40歲以前的卵巢功能下降被稱為早發性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI），其特征為卵泡過早衰竭、月經紊亂，并伴有基礎促卵泡生成激素（FSH）水平升高[1]。卵泡是女性生殖內分泌的基本功能單位，Notch 信號通路在卵泡組裝和生長、減數分裂成熟及卵巢血管生成和類固醇激素產生等事件中起重要作用，也是目前認為參與生殖干細胞干性維持機制的重要信號通路[2-3]。Notch 信號通路異常可致卵泡生長發育障礙。相關臨床研究表明，Notch 基因突變與POI的發病相關[4]，上調Notch1 表達，激活Notch 信號通路，可以提高雌二醇（E2）、降低FSH 水平，促進POI 模型小鼠的卵泡成熟[5]。補腎填精代表方左歸丸出自《景岳全書》，是治療本病的常用方，有大補腎精、養血活血之功效。臨床研究表明，左歸丸可以改善高齡有生育要求婦女的卵巢儲備功能[6]。本課題組前期臨床研究發現，左歸丸可有效改善POI 患者月經情況、全身癥狀和性激素水平，使月經復潮，成功妊娠[7-8]，但其具體作用機制尚不明確。故本研究擬從Notch信號通路的角度探討左歸丸治療POI的可能分子機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物30只SPF級8周齡SD雌性大鼠，平均體質量160 ～180 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，動物質量合格證號：44007200073465。飼養于廣州中醫藥大學第一附屬醫院SPF 級動物實驗室，許可證號：SYXK（粵）2018-0002。

1.2 藥物、儀器與試劑左歸丸（北京同仁堂制藥廠生產，批號：國藥準字Z110207735）；戊酸雌二醇片（法國DELPHARM Lille S.A.S 生產，批號：國藥準字J20130009）；環磷酰胺（山西普德藥業股份有限公司生產，批號：國藥準字H14023686）。Notch1 抗體（美國CST 公司）；Hes1 抗體（美國CST公司）；Hes5抗體（美國Abcam公司）；辣根過氧化物酶標記親和純化山羊抗兔免疫球蛋白[HRPconjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）]（武漢三鷹生物技術有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司）；蛋白質標準品（美國Bio-Rad 公司）；電化學發光（ECL）顯影液（美國ThermoFisher公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色液（福州飛凈生物科技有限公司）。組織脫水包埋機、冷凍臺、切片機（金華科迪醫療器械有限公司）；電泳及電轉設備、凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.3 POI大鼠模型建立給予大鼠適應性喂養1 周，每日行陰道涂片觀察動情周期。30只大鼠動情周期均規律，按隨機數字表選取25只大鼠為造模組，5只為正常組。參考本課題組前期造模方法[9]，造模組分別于第1天腹腔注射環磷酰胺負荷劑量50 mg/kg，繼以5 mg·kg-1·d-1的維持劑量連續注射14 d。正常組每日腹腔注射與造模組等體積的生理鹽水（10 mL·kg-1·d-1）至模型制備結束。造模第7天稱體質量1次，根據體質量變化調整給藥劑量。造模期間每日行陰道涂片觀察動情周期，造模組大鼠均出現動情周期紊亂、間期延長、動情期縮短，提示造模成功，造模期間無大鼠死亡。本實驗經廣州中醫藥大學第一附屬醫院動物倫理委員會批準，倫理批號：TCMF1-2017008。

1.4 分組與干預措施造模成功后將25只大鼠按隨機數字表隨機分為5組，每組各5只，分別為模型組，左歸丸低、高劑量組，戊酸雌二醇低、高劑量組。根據左歸丸及戊酸雌二醇說明書換算標準體質量大鼠每日等效服藥量[10]，將其設置為低劑量，溶于蒸餾水中，故每日每只大鼠灌胃劑量為：左歸丸低劑量組1.8510 g/kg，左歸丸高劑量組3.7020 g/kg，戊酸雌二醇低劑量組0.1028 mg/kg，戊酸雌二醇高劑量組0.2067 mg/kg。正常組及模型組給予等體積生理鹽水。各組從造模結束后第2天開始灌胃，連續30 d。期間每2 周稱體質量1 次，根據體質量變化調整給藥劑量，直至取材。

1.5 觀察指標與方法完成灌胃30 d后的第2天，以水合氯醛麻醉后取大鼠雙側卵巢，用精密電子天平稱取卵巢濕質量，計算卵巢系數。卵巢系數=卵巢濕質量（mg）/大鼠體質量（g）。隨機選取各組大鼠的一側卵巢放入凍存管中，-80 ℃保存，其余卵巢于4%多聚甲醛液固定。

1.5.1 HE染色法觀察卵巢組織形態與卵泡計數 取出固定于4%多聚甲醛液的卵巢組織，梯度酒精脫水后浸沒于無水乙醇二甲苯混合物中透明，浸蠟包埋。將卵巢蠟塊連續切片后，展平撈片，60 ℃烤片2 h，置于生物制片透明劑松節油脫蠟。梯度酒精復水，蘇木素染色3 min，蒸餾水反復浸洗。伊紅染色2 min，70%酒精浸洗至鏡檢著色滿意，中性樹膠封片。顯微鏡觀察并行卵泡計數。各級卵泡的分類參照Myers等的分類方法[11]。

1.5.2 Western Blot法檢測卵巢組織Notch1、Hes1、Hes5蛋白的表達 取出-80 ℃凍存的卵巢組織，稱取30 mg卵巢，按試劑說明書加裂解液混合液抽提卵巢組織總蛋白。制備蛋白標準品并繪制蛋白標準曲線，測定樣品蛋白濃度，配膠、電泳、轉膜，5%脫脂牛奶封閉，4 ℃孵育稀釋后的一抗（Notch1、Hes1、Hes5、內參GAPDH 分別用抗體稀釋液以1∶1000 稀釋）過夜，室溫孵育稀釋后的二抗（用5%牛奶TBST 以1∶10000 稀釋）1 h，TBST 洗膜后，顯影。使用ImageJ 軟件分析條帶灰度值。

1.6 統計方法采用SPSS 26.0統計軟件進行數據分析。服從正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析并進行兩兩比較；否則采用非參數檢驗。不服從正態分布的計量資料以中位數和四分位數[M（P25，P75）]表示，采用非參數檢驗（秩和檢驗）進行統計分析。所有的統計分析檢驗均采用雙側假設檢驗，檢驗水準為α= 0.05，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 左歸丸對POI大鼠體質量及卵巢系數的影響造模前，正常組與模型組的體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。造模第7、14天，與正常組比較，模型組體質量顯著降低（P＜0.05）。造模完成后，與正常組比較，模型組的雙側卵巢質量均降低（P＜0.01），但雙側卵巢系數差異無統計學意義（P＞0.05）。干預30 d 后，左歸丸低、高劑量組及戊酸雌二醇低、高劑量組雙側卵巢質量、卵巢系數均較模型組增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）。具體結果見表1。

表1 各組大鼠實驗期間體質量、卵巢系數比較Table 1 Comparison of body mass and ovarian coefficients among various groups of rats during the experiment（±s）

表1 各組大鼠實驗期間體質量、卵巢系數比較Table 1 Comparison of body mass and ovarian coefficients among various groups of rats during the experiment（±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，與正常組比較

組別正常組模型組左歸丸低劑量組左歸丸高劑量組戊酸雌二醇低劑量組戊酸雌二醇高劑量組鼠數/只555555體質量/g造模第1天226.0±11.0222.0±10.0224.0±9.0222.0±12.0221.0±10.0222.0±10.0造模第7天246.0±14.0230.0±11.0①227.0±8.0①231.0±14.0①229.0±11.0①230.0±9.0①造模第14天260.0±14.0242.0±13.0②241.0±11.0②239.0±14.0②239.0±13.0②241.0±11.0②干預30 d后雙側卵巢質量/mg 92.6±11.573.0±17.0②84.5±6.383.0±12.679.0±15.270.9±9.6干預30 d后雙側卵巢系數/（mg·g-1）0.309±0.0550.274±0.0570.314±0.0210.310±0.0370.297±0.0560.277±0.033

2.2 左歸丸對POI大鼠卵巢組織形態及卵泡數量的影響正常組卵巢皮質、髓質結構清晰，皮質內含各級卵泡結構，卵泡數量豐富，發育良好，并有大量黃體分布；模型組卵巢萎縮，各級卵泡及黃體數量較正常組明顯減少（P＜0.05 或P＜0.01），卵泡內結構破壞，形態不規則，卵巢顆粒細胞層較少，排列混亂，閉鎖卵泡明顯增多；左歸丸低劑量組初級卵泡、次級卵泡、竇卵泡、黃體數量較模型組顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），原始卵泡數量無明顯變化（P＞0.05），可見到少量閉鎖卵泡，髓質內含豐富彈性纖維和血管；戊酸雌二醇低劑量組初級卵泡、竇卵泡、黃體數量較模型組顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），卵巢邊緣可見到少量原始卵泡，原始卵泡及次級卵泡數量無明顯變化（P＞0.05），可見到少量閉鎖卵泡，髓質內含有豐富的彈性纖維和血管。各組卵巢組織形態變化如圖1所示，卵泡及黃體數量比較如表2所示。

表2 各組大鼠各級卵泡及黃體數量比較Table 2 Comparison of the number of follicles at all levels and corpus luteum among various groups of rats [M（P25-P75）或±s]

表2 各組大鼠各級卵泡及黃體數量比較Table 2 Comparison of the number of follicles at all levels and corpus luteum among various groups of rats [M（P25-P75）或±s]

①P＜0.05，②P＜0.01，與正常組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組左歸丸低劑量組戊酸雌二醇低劑量組鼠數/只5555原始卵泡/個70（59，87）16（12.5，19）②30（27，35）36（28，37.5）初級卵泡/個10.2±2.5883.4±2.302①9.6±1.517④9.0±2.236③次級卵泡/個8.0±2.2362.0±1.225②6.6±2.408③5.6±2.191竇卵泡/個16.0±8.9721.8±1.304②13.4±3.847③14.8±2.775④黃體/個21.0±6.6336.4±3.578②17.8±7.887③17.2±2.387③

圖1 各組大鼠卵巢組織形態比較（HE染色，×40）Figure 1 Comparison of ovarian histomorphology in various groups of rats（HE staining，×40）

2.3 各組大鼠卵巢組織Notch信號通路受體Notch1和下游分子Hes1、Hes5 蛋白表達比較與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織Notch1、Hes1、Hes5 蛋白表達水平均有不同程度的下降，其中，Hes1 蛋白表達水平下降顯著（P＜0.01）。與模型組比較，左歸丸低、高劑量組大鼠卵巢組織Notch1、Hes1蛋白表達水平均顯著上升（P＜0.05 或P＜0.01），左歸丸高劑量組Hes5 蛋白表達水平呈上升趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），且2 個劑量組各蛋白表達水平組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，戊酸雌二醇低劑量組大鼠卵巢組織Notch1、Hes1 蛋白表達水平均顯著上升（P＜0.05 或P＜0.01），Hes5 蛋白表達水平呈上升趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），戊酸雌二醇高劑量組的Notch1、Hes1、Hes5 蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。各組卵巢組織Notch1、Hes1、Hes5 蛋白表達水平結果如表3 所示，蛋白電泳結果如圖2所示。

圖2 各組大鼠卵巢組織Notch1、Hes1、Hes5蛋白電泳結果Figure 2 Electrophoresis results of Notch1，Hes1 and Hes5 proteins in ovarian tissues of various groups of rats

表3 各組大鼠干預30 d后卵巢組織Notch1、Hes1、Hes5蛋白相對表達量比較Table 3 Comparison of the relative protein expression levels of Notch1，Hes1 and Hes5 in ovarian tissues among various groups of rats after 30 days of intervention （±s）

表3 各組大鼠干預30 d后卵巢組織Notch1、Hes1、Hes5蛋白相對表達量比較Table 3 Comparison of the relative protein expression levels of Notch1，Hes1 and Hes5 in ovarian tissues among various groups of rats after 30 days of intervention （±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，與正常組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組左歸丸低劑量組左歸丸高劑量組戊酸雌二醇低劑量組戊酸雌二醇高劑量組鼠數/只555555 Notch10.234±0.0260.222±0.0240.344±0.023②④0.365±0.024②④0.334±0.031②④0.271±0.027 Hes12.123±0.1190.627±0.130②1.145±0.258①③1.523±0.363③1.029±0.225②③1.070±0.545 Hes50.753±0.1530.566±0.0840.511±0.1240.746±0.1100.702±0.2690.286±0.125①

3 討論

中醫古籍中未有早發性卵巢功能不全的病名，根據相似的臨床癥狀，將其歸屬于中醫“經水早斷”“月水先閉”“經水不當絕而絕”“年未老而經水斷”等范疇。腎者，先天之本，藏精，主生殖。《傅青主女科》云：“有年未至七七而經水先斷者，人以為血枯經閉也，誰知是心肝脾氣之郁乎……然則經水早斷，似乎腎水衰涸。”雖然古今各醫家觀念有所不同，但基本形成了以腎虛為本，肝、脾、心、腎之間相互為病的認識。補腎填精法，即通過補益腎氣、填精益髓的藥物組合，使腎氣充盛，精血滿盈，從而達到改善卵巢功能的目的，是治療本病的基本治法。其代表方左歸丸出自明代張景岳的《景岳全書》，方中以熟地黃為君藥，補腎養陰，填精益髓，山茱萸滋養肝腎，山藥補脾益陰，枸杞子補腎益精，加龜膠、鹿膠為血肉有情之品，填精補髓養血之力尤甚，佐牛膝補腎強腰，活血化瘀，以菟絲子平補腎中陰陽，“陽化氣，陰成形”，體現張景岳“善補陰者，必于陽中求陰，則陰得陽升而泉源不竭”的治法特點。

有研究表明，雌性大鼠在6周左右性成熟，而后進入成年期，在15～20個月（600 d）之間進入更年期[12]，本研究選擇實驗動物為8 周齡SD 雌性大鼠，實驗周期（含適應性喂養、造模和藥物灌胃）共7周，在實驗周期內大鼠均處于青壯年期，與臨床POI患者年齡基本匹配。在POI的相關基礎研究中，化療損傷卵巢模型與免疫模型、雷公藤多苷模型、代謝模型等相比，具有成功率高、簡便易行的特點[13]。研究發現，化療源性卵巢功能損傷隨著時間的推移可能出現不同程度的卵巢功能恢復[14]。本研究根據團隊前期研究探索，利用環磷酰胺的生殖毒性建立POI 的大鼠模型[9]，結果顯示，本研究所采用的劑量造模死亡率低，并在造模30 d后仍能觀察到模型組大鼠體質量、卵巢質量較正常組明顯下降，HE 染色仍可見卵泡結構明顯破壞，各級卵泡及黃體數量仍較正常組顯著下降，模型效果較持久穩定。

Notch 信號通路是一條普遍存在且進化上保守的細胞內通路，參與卵子發生、卵巢激素分泌，調控生殖干細胞的增殖分化[2-3]。Notch1、Hes1、Hes5 是Notch 通路下游重要的受體和相關靶分子，其蛋白的表達量可以反映Notch 信號通路的強弱。卵泡的生長發育發生涉及多個周期的有絲分裂，卵泡細胞分化過程中從有絲分裂到內復制的轉變受到Notch 信號通路的調控，抑制Notch 通路可阻止小鼠卵母細胞進入減數分裂[15]；Notch 信號通路調控卵巢顆粒細胞分化和增殖的平衡，抑制Notch信號通路表達可抑制顆粒細胞增殖[16]。Notch 通過調控類固醇生物合成途徑中的酶表達，調節性激素的分泌[17]。卵巢表面上皮細胞中的Notch1、Hes1和Hes5 以及生殖干細胞標記物Mvh 和Oct4 的水平隨著生殖年齡的增長而顯著降低[18]。通過RNA 串擾下調Notch信號通路受體，可導致生殖干細胞的死亡和衰減，卵巢功能衰退[17]。其中，Hes1 還與原始卵泡池的形成和募集調控[19]、卵母細胞的發育成熟密切相關，敲除Hes1 的小鼠卵母細胞發育受到抑制、細胞凋亡增加，卵母細胞數量顯著下降[20]。本研究結果顯示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠動情周期紊亂，雙側卵巢萎縮，卵巢質量明顯下降。病理切片顯示：卵巢組織內各級生長卵泡較正常組顯著減少，卵泡結構破壞，閉鎖卵泡增加，顆粒細胞排列紊亂，卵巢組織中Notch1、Hes1、Hes5 蛋白表達均有不同程度下降，其中，Hes1 蛋白表達下降顯著，提示POI 大鼠存在卵泡生長發育障礙，其作用機制可能與Notch信號通路的表達下調有關。

本研究給予左歸丸及戊酸雌二醇干預30 d后，結果顯示，與模型組比較，除戊酸雌二醇高劑量組外，各干預組的卵巢質量、卵巢系數均有所恢復，其中左歸丸組的恢復速度較戊酸雌二醇組快，但未能得出統計學差異，原因可能與樣本量偏小、干預時間不足有關。卵巢病理組織學觀察各級生長卵泡和閉鎖卵泡計數能直觀地反映卵巢儲備功能，可見左歸丸組POI大鼠的各級生長卵泡和黃體數量較模型組顯著增加，而戊酸雌二醇組初級卵泡、竇卵泡、黃體數量較模型組明顯改善，但原始卵泡、次級卵泡數量變化不明顯。腎藏精，主生殖。腎精是卵泡生長的物質來源，左歸丸組方注重調節腎的陰陽平衡，雖以補腎陰為主，然補陰之中寓有補陽之用，又佐以牛膝補腎強腰、活血通經，合方有大補腎精、養血活血之功，可促進卵泡的生長發育，改善卵巢儲備功能。左歸丸各劑量組均能顯著促進Notch信號通路關鍵組分Notch1、Hes1 蛋白表達，其中左歸丸高劑量組還能增強Hes5 蛋白表達，戊酸雌二醇低劑量組能改善Notch1、Hes1、Hes5 蛋白表達，戊酸雌二醇高劑量組改善均不明顯，提示左歸丸可能通過調節Notch信號通路的表達，改善各級卵泡的生長發育，改善卵巢功能。

綜上所述，左歸丸可以有效改善環磷酰胺所致POI模型大鼠的卵巢功能，其機制可能與促進卵巢組織Notch信號通路的關鍵組分Notch1、Hes1蛋白表達，改善卵泡生長發育，緩解卵巢毒性損傷有關。今后的研究中可添加Notch信號通路抑制劑進行比較分析，進一步驗證實驗結論，深入探討左歸丸的具體作用靶點。