基于Bcl-2/Bax凋亡探討仙子益真膠囊對大鼠卵巢儲備功能減退的作用機制

溫丹婷， 彭瀟， 鄭瑋琳， 徐珉

（1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東廣州 510045；2.廣東省中醫院，廣東廣州 510120；3.廣東省第二人民醫院，廣東廣州 510310）

卵巢功能過早衰竭是目前嚴重影響女性生殖健康的臨床常見疑難病，如何治療和延緩卵巢儲備功能減退（diminished ovarian reserve，DOR）仍然是目前婦科臨床處理過程中最具挑戰性的問題。中醫藥在提高DOR 治療有效率及穩定病情方面有一定優勢。中藥復方仙子益真膠囊是根據多年的臨床觀察數據與基礎研究成果，結合中醫經典理論與全國名老中醫李麗蕓教授“調經重在補腎”的學術思想，提煉、創制而來的，具有滋養肝腎、填精益髓功效，前期臨床療效研究已肯定仙子益真膠囊治療DOR 的有效性、安全性和穩定性。本課題組前期研究證實，仙子益真膠囊可以提高卵巢早衰模型小鼠血清雌二醇（E2）含量，降低卵泡刺激素（FSH）、促黃體生成素（LH）含量，改善卵巢早衰小鼠生殖內分泌環境[1-2]，亦可有效改善雷公藤多苷誘導DOR 大鼠卵巢功能，提高卵巢儲備功能[3]。但仙子益真膠囊的治療機制仍未完全闡明，限制了其推廣運用。本研究以Bcl-2/Bax凋亡途徑為著眼點，探討仙子益真膠囊治療DOR的作用機制，旨在明確其關鍵作用靶點，以期為應用仙子益真膠囊臨床早期預防和解決DOR 提供實驗依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物60只12周齡SPF 級雌性SD 大鼠，體質量250 ～270 g，由南方醫科大學實驗動物中心提供[SCXK（粵）2016-0041]，動物質量合格證編號：44002100014319。飼養于室溫22～26 ℃、明暗各12 h 的SPF 級動物實驗室內，適應性喂養1 周后備用。實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2018-0094。

1.2 實驗藥品仙子益真膠囊（由熟地黃、菟絲子等組成，每粒約含生藥量1.65 g），由廣東省中醫院提供，粵藥制字：Z20070627，生產批號：189101；雷公藤多苷片，遠大醫藥黃石飛云制藥有限公司生產，批號：20170901；戊酸雌二醇片，拜耳醫藥保健有限公司生產，批號：2011361A；地屈孕酮片，荷蘭Abbott Biologicals B.V 公司生產，批號：1091278。

1.3 主要試劑與儀器核轉錄因子kappaB（NF-κB）p65抗體（美國Cell Signaling公司）；雌激素受體α（ERα）抗體、孕激素受體（PR）抗體（美國Santa Cruz公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（美國Thermo 公司）；蛋白酶抑制劑（瑞士Roche公司）；放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液（碧云天生物有限公司）；檸檬酸組織抗原修復液[邁新公司（中國）]；逆轉錄酶試劑盒（美國Promega 公司）；TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）；即用型高效免疫組化二抗試劑盒[優寧維公司（中國）]。酶標儀（型號：EONC）、PCR 擴增儀（型號：CFX96）（美國Bio-Rad 公司）；凝膠成像分析儀（上海培清公司，型號：JS-680B）；漩渦混合器（上海精科實業有限公司，型號：XW-80A）；臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀公司，型號：TGL-16）；化學發光成像系統（美國Bio-Rad 公司）；轉移電泳槽（廣州譽維生物科技儀器有限公司，型號：VE-186）；垂直電泳槽（廣州譽維生物科技儀器有限公司，型號：VE-180B）。

1.4 DOR 大鼠模型構建SPF級健康雌性大鼠適應性喂養，每日進行陰道涂片檢查，隨機抽取性周期正常的大鼠10只作為正常組，其余的為造模誘導組。正常組給予等體積生理鹽水灌胃。造模誘導組參照文獻研究[4]給予雷公藤多苷片50 mg·kg-1灌胃，每日2次，連續28 d。模型建立開始，每天通過觀察大鼠陰道脫落細胞涂片了解大鼠動情周期變化。如果出現動情期延長或動情周期延長，可判斷動情周期紊亂；如出現持續10 d 及以上的動情間期，則判斷動情周期失常；當出現動情周期失常，陰道角化上皮細胞減少，有核上皮細胞混雜，表示建立模型成功[5]。將造模組大鼠按隨機數字表分為模型組，中藥低、中、高劑量組，西藥組，每組10只。

1.5 分組與給藥造模第14天開始給藥。給藥劑量按成人體質量（kg）的臨床用藥劑量以人鼠比例換算[6]，藥物均溶于生理鹽水制成等體積混懸液灌胃。正常組給予生理鹽水10 mL/kg 灌胃，中藥低、中、高劑量組給予仙子益真膠囊混懸液0.625、1.25、2.5 g·kg-1·d-1灌胃，西藥組給予補佳樂、地屈孕酮灌胃（具體方法：第1天開始，戊酸雌二醇0.14 mg·kg-1·d-1，連續4 d；第5天，地屈孕酮片0.92 mg·kg-1·d-1，1 d。第6天，停藥1 d 后，如此繼續序貫用藥）。干預28 d后，選擇動情間期取材。正常組給予等體積生理鹽水灌胃。

1.6 指標檢測與方法

1.6.1 實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）法檢測大鼠卵巢內凋亡因子Bcl-2、Bax、Caspase-3 和p53 mRNA表達水平 應用TRIzol試劑提取卵巢組織的總RNA。Bcl-2、Bax、Caspase-3 和p53 以及β-actin mRNA 引物的合成均由華大基因公司完成。RT-PCR 引物序列見表1。取RNA 樣品，用核酸分析儀進行定量。以5 μL RNA 作為模板逆轉錄合成cDNA，按照SYBR Green PCR Reagents 說明書應用7500 Real Time PCR System 進行擴增。反應條件如下：95 ℃預變性3 min，1 個循環；95 ℃變性10 s，60 ℃30 s 退火及延伸，共持續40 個循環。每個循環在60 ℃延伸時收集熒光值，測定達到熒光閾值時的最小循環次數（Ct 值），完成后進行溶解曲線測定。以β-actin 為內參基因，2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ctβ-actin）處理組-（Ct目的基因-Ctβ-actin）對照組。溶解曲線程序設置為：95 ℃10 s；65 ～95 ℃，每0.5 ℃進行1次溶解曲線分析。記錄數據并分析實驗結果。

表1 RT-PCR 引物序列Table 1 RT-PCR primer sequence

1.6.2 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測卵巢組織中NF-κB p65 蛋白及子宮內膜ERα、PR 蛋白表達水平 液氮脆化卵巢組織、子宮內膜組織后研磨，用加入蛋白酶抑制劑的RIPA 強裂解液在冰上裂解30 min，振蕩，離心，轉移上清至新EP管。用BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。用5×Loading Buffer 混合樣品，100 ℃10 min 變性，離心，-80 ℃保存。取30 μg 相應蛋白樣品上樣，100 V恒壓跑電泳，300 mA 90 min 轉膜，50 g/L奶粉封閉，一抗（NF-κB p651∶100稀釋，ERα 1∶200稀釋，PR 1∶200 稀釋），4 ℃冰箱孵育過夜后，TBST 洗膜10 min × 3 次。第2天，二抗（1∶5000稀釋）室溫孵育1 h后，TBST洗膜10 min×3次。于化學發光成像系統免疫發光，用Image Lab 顯影成像。實驗至少重復3次，應用IamgeJ軟件分析條帶灰度值。

1.7 統計方法采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。符合正態分布與方差齊性的兩組間計量資料比較采用兩獨立樣本t檢驗。多組間計量資料比較符合條件，采用單因素設計方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法；多組間計量資料比較不符合應用條件，采用Welch’s ANOVA，組間兩兩比較采用Games-Howell 法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠卵巢組織凋亡因子Bax、Caspase-3、p53、Bcl-2 mRNA表達比較圖1、圖2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織Bax、Caspase-3、p53 mRNA 表達水平明顯升高，Bcl-2 mRNA表達水平明顯降低，Bcl-2/Bax比率下降（均P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組大鼠卵巢組織Bax、Caspase-3、p53 mRNA 表達水平呈劑量依賴性降低，Bcl-2 mRNA 表達水平呈劑量依賴性升高（均P＜0.05），Bcl-2/Bax 比率升高。以上結果表明，雷公藤多苷誘導的DOR 大鼠存在卵巢細胞凋亡，仙子益真膠囊可減少DOR 大鼠卵巢細胞凋亡。

圖1 各組大鼠卵巢組織中Bax（A）、Caspase-3（B）、p53（C）mRNA相對表達量比較Figure 1 Comparison of relative mRNA expression levels of Bax（A），Caspase-3（B）and p53（C）in ovarian tissues among various groups of rats

圖2 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2 mRNA相對表達量（A）及Bcl-2/Bax比率（B）比較Figure 2 Comparison of relative mRNA expression level of Bcl-2（A）in ovarian tissues and Bcl-2/Bax ratio（B）among various groups of rats

2.2 各組大鼠卵巢組織NF-κB p65蛋白表達比較圖3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織NF-κB p65 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和西藥組大鼠卵巢組織NF-κB p65 蛋白表達水平升高，其中，中藥中、高劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠卵巢組織NF-κB p65蛋白表達比較Figure 3 Comparison of NF-κB p65 protein expression in ovarian tissues among various groups of rats

2.3 各組大鼠子宮內膜組織ERα、PR 蛋白表達比較圖4結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠子宮內膜組織ERα、PR蛋白表達水平明顯下降（均P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及西藥組大鼠子宮內膜組織ERα、PR 蛋白表達水平明顯升高（均P＜0.05），且中藥各組呈劑量依賴性。

圖4 各組大鼠子宮內膜組織中ERα（A）、PR（B）蛋白表達量及ERα、PR蛋白電泳圖（C）Figrure 4 Expression of protein expression levels of and electrophoretogram of ERα and PR in endometrial tissues in various groups of rats

3 討論

中醫學“腎-天癸-沖任-胞宮”之性生殖鏈與現代醫學“下丘腦-垂體-卵巢軸”極為相似。現代醫學認為，下丘腦、垂體、卵巢釋放的激素調節女性性周期，“天癸”可能相當于垂體、卵巢、睪丸等性腺的內分泌素。“腎”主宰女性生殖機能的發育、旺盛與衰退，“腎”對女性卵巢生理功能的實現起著決定性作用。臨床報道及藥理研究表明，雷公藤多苷可損傷女性卵巢功能且損傷有可逆性，“以方測證”證實該模型為腎精氣虧虛卵巢功能低下模型[7]。以雷公藤多苷50 mg/kg 劑量造模，其穩定性和可逆性均較好[7]。因此，本研究確定雷公藤多苷片50 mg/kg灌胃大鼠28 d構建卵巢功能減退（DOR）藥效學研究動物模型，并基于大鼠陰道上皮細胞會隨卵巢激素的周期性變化而變化的特點，通過陰道涂片法檢測大鼠動情周期，直觀判斷其性腺功能是否正常[8]。本課題組前期研究表明，仙子益真膠囊能夠有效改善雷公藤多苷導致的大鼠卵巢功能低下的狀況，提高卵巢儲備功能[3]。故本研究選擇雷公藤多苷構建DOR實驗動物模型，高度模擬了女性卵巢儲備功能減退的狀態，結合中醫基礎理論，進一步從細胞分子基因水平探討了仙子益真膠囊對DOR 的治療作用，以Bcl-2/Bax凋亡途徑為著眼點，闡明其治療DOR的可能機制和作用靶點，可為院內制劑的新藥開發提供基礎數據。

3.1 仙子益真膠囊對DOR大鼠卵巢Bcl-2/Bax及相關因子的影響細胞凋亡是卵巢功能下降的病理特征之一。凋亡過程受多基因調控，研究表明，凋亡信號傳導途徑有細胞表面死亡受體通路、線粒體通路以及內質網通路，其中，Caspase-3是最重要的細胞凋亡效應蛋白，能夠參與多種途徑誘導細胞凋亡，是凋亡的主要執行者[9]。而p53基因作為轉錄因子，廣泛存在于卵巢組織，監控和調節細胞的生存或凋亡，影響卵子的發育與成熟。p53基因被敲除后，顆粒細胞的凋亡率明顯降低，卵泡閉鎖的數目也顯著降低[10]。

Bcl-2 是在B 細胞濾泡性淋巴瘤染色體斷裂點發現的凋亡抑制基因。而Bax 則是Bcl-2 家族中研究最為廣泛的促凋亡基因，在凋亡過程中起樞紐作用。Bcl-2 和Bax 蛋白相互作用可形成異源二聚體，抑制凋亡；而若是Bax蛋白之間相互作用則可形成同源二聚體，從而促進凋亡[11]。Bcl-2/Bax 比率決定細胞凋亡發生與否，有“死亡開關”之稱。若細胞呈Bax 過表達，可使細胞內Caspase 激活效應增強[12]，并可拮抗Bcl-2 對細胞的保護作用，進而引起細胞的凋亡。

研究發現，Bcl-2/Bax 表達對卵泡的生長發育有調控作用。卵泡在生長發育過程中的大量丟失與Bax 的持續表達相關，而當卵泡需要進一步增殖時，Bcl-2 選擇性表達，可與Bax 互相調節，Bc1-2＞Bax 則細胞趨于存活，Bax＞Bc1-2 則細胞趨于凋亡，使卵巢儲備維持在合理水平。然而，當Bcl-2 與Bax 表達失調時，在發育過程中的卵泡開始凋亡，形成閉鎖卵泡，最終導致DOR[13]。

NF-κB 作為炎癥啟動和調節過程的關鍵轉錄因子[14]，在炎癥反應中起重要作用。NF-κB 介導的炎癥信號通路是調控炎癥反應的經典信號通路，參與多囊卵巢綜合征（PCOS）患者血管內皮損傷[15]。NF-κB對細胞凋亡存在雙向調節作用，既可以促進凋亡也可以抑制凋亡。NF-κB 過度活化，一方面可激活Caspase-3、Bcl-2 使兩者的表達增加，誘導細胞凋亡；一方面可以激活同處一個信號傳導系統中位于其下游基因的Bcl-2，過度表達的Bcl-2發揮其自身的抑凋亡作用，或與NF-κB在細胞質內形成Bcl-2-NF-κB 復合物，發揮抑凋亡的作用[16-17]。

本研究結果表明，仙子益真膠囊可通過上調Bcl-2、下調Bax 及相關凋亡因子的表達來減少DOR 大鼠卵巢顆粒細胞凋亡，從而改善卵巢儲備功能，保護卵巢。亦提示NF-κB p65活化使Bcl-2過表達或者形成復合物而發揮其抑凋亡作用可能是仙子益真膠囊治療DOR 的作用機制之一，此為中藥復方多靶點多通路作用的起效模式的論證提供了科學依據。

3.2 仙子益真膠囊對DOR大鼠子宮內膜ERα、PR蛋白表達的影響雌激素（E2）、孕激素（P）以及雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）是形成良好內膜容受性的重要因素，其中任一因素表達失常將導致著床失敗[18]。本研究結果顯示：雷公藤多苷誘導的DOR模型大鼠子宮內膜PR、ERα蛋白表達明顯下降；中藥低、中、高劑量組大鼠子宮內膜PR、ERα 蛋白表達較模型組呈劑量依賴升高。表明仙子益真膠囊可改善DOR 大鼠卵巢儲備功能，還可改善子宮內膜容受性。

綜上所述，仙子益真膠囊可抑制卵巢顆粒細胞凋亡，改善卵巢儲備功能，保護卵巢，還可改善子宮內膜容受性，從而有利于胚泡的植入，以提高DOR 患者胚胎著床率。本研究結果可有助于進一步完善生殖生理體系內容，豐富“腎主生殖”理論，亦顯示仙子益真膠囊治療DOR 具有良好的應用前景。