黃芩素對膿毒癥大鼠的治療作用及機制

楊麗， 陳衛， 華麗， 呂秀華

（濟南市人民醫院，山東濟南 271100）

膿毒癥（sepsis）是指因感染引起的宿主反應失調導致全身多臟器功能障礙的臨床綜合征[1]。膿毒癥是嚴重的燒（創）傷、感染、休克或者大手術后常見的并發癥，其發病機制十分復雜，主要涉及炎癥反應失衡、免疫功能紊亂、凝血功能障礙等多方面病理生理過程[2]。膿毒癥病情兇險，死亡率高，一直是重癥醫學研究領域的熱點。臨床常用的膿毒癥治療方法主要有液體治療與復蘇，抗感染治療和血流動力學支持[3]。中藥治療膿毒癥具有較好療效[4]，未來中藥及其活性成分治療可能成為膿毒癥治療的新方向。分析《太平圣惠方》治療膿毒癥的用藥規律，發現治療膿毒癥藥物使用頻次位于前5位的是大黃、黃芩、甘草、梔子、麥冬等[5]。黃芩為唇形科（Labiatae）黃芩屬（Scutellaria）多年生草本中藥植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，味苦，性寒，歸肺、膽、脾胃、大腸、小腸經，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效。黃芩素（Baicalein），又名黃芩苷元、黃芩黃素，是從黃芩中提取的有效成分，其在生藥中占5.41%，是黃芩的主要藥效物質基礎，具有抗病毒、抗菌、抗過敏、免疫調節等多種藥理作用[6-7]。探討黃芩素對膿毒癥的治療作用具有重要的研究意義，但目前相關黃芩素抗膿毒癥的研究較少，因此，本研究構建膿毒癥大鼠模型，觀察黃芩素的治療機制，以期為臨床膿毒癥治療提供參考依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物40只SD大鼠（雌雄各半），體質量190 ～210 g，購自南京君科生物工程公司，動物質量合格證號：SCXK（蘇）2016-0007。在山東大學動物實驗中心按照實驗動物管理條例進行飼養管理。飼養環境：溫度（24 ± 1）℃，濕度45%～50%，大鼠活動飲水自由。大鼠適應性喂養1周。

1.2 藥物、試劑與儀器黃芩，購自成都嘉葉生物科技有限公司；注射用烏司他丁，購自廣東天普生化醫藥公司（批號：國藥準字H19990133）。內毒素，購自上海澤葉生物科技公司；活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）及血漿纖維蛋白原（FIB）檢測試劑盒，購自上海圻明生物科技有限公司；異硫氰酸熒光素標記CD3（FITCCD3+）、藻紅蛋白標記CD4（PE-CD4+）、PE-Cy5-CD8+單克隆抗體，購自上海酶研生物科技有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1 抗體、Caspase-11抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗，購自上海嘉恒生物科技公司；白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒，購自上海恒斐生物科技公司；凝血分析儀，購自武漢科爾達醫療科技有限公司；Attune NxT流式細胞儀，購自北京昊諾斯科技公司。

1.3 黃芩素的提取[8]取黃芩20 kg 粉碎成粗粉，用乙醇回流提取3 次。減壓回收乙醇至無乙醇蒸出，殘余物加入85%乙醇，加熱使大部分溶解，過濾，濾液用柱層析用硅膠，以柱層析法進行分離，用石油醚與氯仿按照體積分數1∶3 的比例洗脫。收取第2條黃色帶，即得漢黃芩素（約100 g），經純度檢查，主要為黃芩素，含量大于90%。

1.4 分組與建模將40只大鼠隨機分為正常組、模型組、黃芩素低劑量組、黃芩素高劑量組、烏司他丁組，每組8只。除正常組外，其余3組大鼠建立膿毒癥模型[7]：根據大鼠體質量準備內毒素（10 mg/kg），加生理鹽水溶解為10 mL，經大鼠尾部靜脈注射（0.45 mL/kg）。建模后0.5 h，大鼠出現精神萎靡、活動減少、毛色雜亂無光澤、呼吸稍促、喜飲水和解稀便等膿毒癥表現。將術后24 h作為時間觀察截點，結果顯示建模成功[9]。

1.5 干預方法黃芩素低、高劑量組大鼠分別給予黃芩素（生理鹽水溶解）100、200 mg·kg-1·d-1腹腔注射，烏司他丁組大鼠給予注射用烏司他丁（生理鹽水溶解）20萬U/kg腹腔注射，正常組大鼠腹腔注射等體積的生理鹽水，每日1次，共干預3 d。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 凝血分析儀檢測大鼠凝血指標 經大鼠尾部取血2 mL，應用凝血分析儀檢測血漿APTT、PT及FIB 水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6.2 ELISA法檢測大鼠血清TNF-α、IL-6水平 經大鼠尾部取血2 mL，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6.3 流式細胞術檢測大鼠外周血T淋巴細胞亞群CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴細胞百分比和CD4+T細胞/CD8+T細胞（CD4+/CD8+）比值及輔助性T 淋巴細胞（Th）1/Th2 比值 取大鼠靜脈血2 mL，根據試劑盒操作說明書充分標記，采用流式細胞儀檢測T 淋巴細胞亞群，計數CD3+T、CD4+T、CD8+T 細胞的百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2比值。

1.6.4 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察大鼠肺部病理損傷情況 建模成功后將大鼠用戊巴比妥麻醉處死，取肺組織，常規脫水后，浸蠟，石蠟包埋，制備4 μm 切片，脫蠟，水合，透明封片，染色。光鏡下觀察肺泡、肺間質水腫情況變化等。

1.6.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測大鼠肺組織Caspase-1、Caspase-11 蛋白表達水平 取大鼠肺組織，剪碎后加入裂解液，取上清液，通過蛋白定量分析，上樣，電泳，轉膜，膜封閉，Caspase-1、Caspase-11 一抗（稀釋比例1∶1000）4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG 二抗（稀釋比例1∶4000）孵育2 h，顯色等步驟，應用成像系統對電泳條帶的光密度進行分析。

1.7 統計方法采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數± 標準差（±s）表示，多組間比較行單因素方差分析或重復測量方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血漿APTT、PT、FIB水平比較表1結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血漿APTT、PT、FIB 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩素低、高劑量組和烏司他丁組血漿APTT、PT、FIB 水平均有所下降（P＜0.05）；黃芩素高劑量組與烏司他丁組各指標比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血漿APTT、PT、FIB水平比較Table 1 Comparison of plasma APTT，PT and FIB levels among various groups of rats （±s）

表1 各組大鼠血漿APTT、PT、FIB水平比較Table 1 Comparison of plasma APTT，PT and FIB levels among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與黃芩素低劑量組比較

組別正常組模型組黃芩素低劑量組黃芩素高劑量組烏司他丁組F值P值鼠數/只88888 APTT/s 14.25±2.9418.26±2.03①16.26±2.37①②15.02±1.56①②③15.65±2.18①②③3.621＜0.001 PT/s 11.21±0.7617.68±2.68①16.43±1.83①②15.31±1.16①②③15.36±1.94①②③14.560＜0.001 FIB/（g·L-1）2.12±1.613.59±2.65①2.46±1.66①②2.12±1.01①②③2.13±1.05①②③3.421＜0.05

2.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平比較表2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩素低、高劑量組和烏司他丁組血清TNF-α、IL-6 水平均有所下降（P＜0.05）；而黃芩素高劑量組與烏司他丁組血清TNF-α、IL-6 水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較Table 2 Comparison of serum TNF-α and IL-6 levels among various groups of rats （±s，pg·mL-1）

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較Table 2 Comparison of serum TNF-α and IL-6 levels among various groups of rats （±s，pg·mL-1）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與黃芩素低劑量組比較

組別正常組模型組黃芩素低劑量組黃芩素高劑量組烏司他丁組F值P值鼠數/只88888 TNF-α 20.26±1.2142.35±2.34①35.26±2.45①②24.23±1.52①②③25.35±1.68①②③181.800＜0.001 IL-621.02±1.0267.56±2.35①43.57±3.22①②38.26±2.11①②③39.44±1.13①②③492.700＜0.001

2.3 各組大鼠外周血中CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2 比值比較表3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠外周血中CD3+T、CD4+T 淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2 比值降低（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩素低、高劑量組和烏司他丁組外周血中CD3+T、CD4+T 淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2 比值均有所升高（P＜0.05）；黃芩素高劑量組與烏司他丁組各指標比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。各組大鼠外周血CD8+T 淋巴細胞百分比比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠外周血中CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2比值比較Table 3 Comparison of CD3+T，CD4+T，CD8+T lymphocyte percentages and CD4+/CD8+ratio and Th1/Th2 ratio in peripheral blood among various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠外周血中CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2比值比較Table 3 Comparison of CD3+T，CD4+T，CD8+T lymphocyte percentages and CD4+/CD8+ratio and Th1/Th2 ratio in peripheral blood among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與黃芩素低劑量組比較

組別正常組模型組黃芩素低劑量組黃芩素高劑量組烏司他丁組F值P值鼠數/只88888 CD3+T淋巴細胞/%42.21±6.4938.65±5.43①43.46±3.21①②44.12±2.54①②③45.26±4.52①②③11.050＜0.001 CD4+T淋巴細胞/%25.32±1.8920.26±1.03①46.26±1.01①②40.05±1.04①②③40.35±0.98①②③758.500＜0.001 CD8+T淋巴細胞/%22.32±4.2121.65±2.7622.32±2.2322.31±1.9823.21±2.240.3140.866 CD4+/CD8+比值1.34±0.291.31±0.13①2.01±0.23①②1.65±0.16①②③1.68±0.21①②③14.700＜0.001 Th1/Th2比值0.579±0.0450.315±0.059①0.545±0.068①②0.622±0.053①②③0.631±0.037①②③46.940＜0.001

2.4 各組大鼠肺組織病理表現比較圖1結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肺組織肺泡腔縮小，肺間質水腫及肺實質變小，伴有大量炎性細胞浸潤與出血；與模型組比較，黃芩素低劑量組肺組織病理損傷程度無明顯差異，黃芩素高劑量組和烏司他丁組肺組織損傷范圍較小，部分肺泡腔內僅僅出現少量出血與炎性細胞浸潤，肺實變與肺間質水腫較輕。

圖1 各組大鼠肺組織病理表現比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the histopathological manifestations of the lung tissue among various groups of rats（by HE staining，×200）

2.5 各組大鼠肺組織Caspase-1、Caspase-11蛋白表達水平比較表4、圖2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肺組織中Caspase-1、Caspase-11蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩素低、高劑量組和烏司他丁組Caspase-1、Caspase-11 蛋白表達水平均有所降低（P＜0.05），黃芩素高劑量組與烏司他丁組各指標比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠肺組織Caspase-1、Caspase-11的Western Blot電泳條帶圖Figure 2 Western Blot electrophoresis bands of Caspase-1 and Caspase-11 proteins in lung tissues in various groups of rats

表4 各組大鼠肺組織Caspase-1、Caspase-11蛋白表達水平比較Table 4 Comparison of protein expression levels of Caspase-1 and Caspase-11 in lung tissues among various groups of rats

3 討論

膿毒癥患者體內存在炎性反應狀態與免疫紊亂，兩者可相互影響[10]。膿毒癥是一種失控的、持久性炎癥反應，是由感染因素誘發的全身性炎性反應綜合征（SIRS）。臨床中與膿毒癥相關的研究眾多，而感染及其所導致的機體變化是臨床研究的重點[11]。IL-6 是公認的促炎因子，主要由單核-巨噬細胞、T淋巴細胞和纖維母細胞合成分泌，是急性相反應的始發因子和主要物質，也是促進肝臟合成急相蛋白的主要細胞因子[12]。TNF-α是具有免疫調節作用的細胞因子，在膿毒癥初期表達升高可以導致局部免疫炎癥反應，并可隨著疾病發展升高誘導器官損傷[13]。T淋巴細胞亞群在一定程度上能夠反映機體的細胞免疫狀態。CD3+T 為T 淋巴細胞總數，CD4+T 及CD8+T 為其亞型。CD4+T 為輔助/誘導T 淋巴細胞（Th），且有輔助淋巴細胞產生抗體，誘導T淋巴細胞轉變為效應細胞等功能，CD8+T 為抑制/殺傷T 淋巴細胞（Ts），具有介導對病原體感染的自身細胞殺傷和溶解作用，此兩種細胞均為特異性細胞免疫的主要效應細胞[14]。在正常情況下，CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴細胞和CD4+T/CD8+T值在正常范圍，CD4+T、CD8+T 淋巴細胞通常處于動態平衡及相互反饋調節狀態。CD3+T、CD4+T、CD8+T 淋巴細胞和CD4+/CD8+比值的改變代表機體免疫功能的改變[15]。膿毒癥患者可以出現免疫失衡，表現為CD3+T、CD4+T 淋巴細胞和CD4+/CD8+比值的下降，且其與疾病嚴重程度存在一定相關性。CD3+T、CD4+T 淋巴細胞和CD4+/CD8+比值可以作為膿毒癥治療過程中疾病嚴重程度的檢測指標[15]。Th1/Th2的平衡對維持正常免疫應答起重要的作用。正常情況下，Th1/Th2處于相對平衡的狀態。探討膿毒癥患者Th1/Th2細胞失衡與疾病嚴重程度、肺損傷的關系顯示，Th1/Th2值的降低預示著疾病嚴重程度的加大，預后不良，同時膿毒癥合并肺損傷患者促炎Th1 細胞增高，Th1/Th2 平衡向Th1 方向漂移[16]。

本研究結果顯示，經黃芩素干預后，膿毒癥大鼠血清升高的TNF-α、IL-6 水平均有所下降，降低的外周血CD3+T、CD4+T 淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2比值有所升高，黃芩素高劑量組各指標與烏司他丁組比較，差異不明顯。表明黃芩素可下調膿毒癥大鼠的炎性因子水平、改善免疫紊亂。

作為膿毒癥的核心機制，過于強烈的免疫反應常常伴隨大量炎癥細胞因子的釋放，包括IL-6、TNF-α 等。對Caspase-11 介導的非經典炎性體通路在膿毒癥中介導著多種炎癥介質的釋放。細胞焦亡在膿毒癥過于強烈的免疫反應中發揮了重要的作用，被病原體入侵的細胞通過細胞焦亡釋放出大量促炎信號和病原體，并引發級聯反應，關于細胞焦亡的研究揭示了Caspase 家族在其中所扮演的重要角色。細胞焦亡存在2種途徑，分別為依賴Caspase-11的非經典途徑和依賴Caspase-1 的經典途徑。其中，Caspase-11與細胞焦亡關系最為密切。Caspase-11被認為可調節細胞焦亡的發生，敲除Caspase-11 可以明顯改善膿毒癥小鼠的生存率[17]。膿毒癥可引起小鼠海馬神經元損傷及Caspase-1 介導的焦亡的激活，抑制Caspase-1 介導的焦亡具有神經元保護和認知保護作用[18]。

本研究結果顯示，模型組大鼠肺組織Caspase-11、Caspase-1 蛋白表達水平較正常組下降，干預后，黃芩素低、高劑量組和烏司他丁組Caspase-11、Caspase-1 蛋白表達水平較模型組升高，黃芩素高劑量組各指標與烏司他丁組比較，差異無統計學意義。表明黃芩素可能通過抑制膿毒癥大鼠肺組織Caspase-11、Caspase-1 蛋白表達，抑制細胞焦亡，進而減輕炎癥反應，從而減輕膿毒癥器官損害。

凝血系統與炎癥反應共同參與膿毒癥的發生發展。膿毒癥患者多數具有凝血功能障礙，膿毒癥凝血功能障礙是一個動態連續的病理過程，其發病機制是由促凝機制上調、天然抗凝機制下調及纖溶系統受抑制共同驅動的，導致微循環障礙，以至發生多臟器功能的障礙[19]。膿毒癥嚴重時還會發生血栓形成和彌漫性出血的暴發性彌散性血管內凝血（DIC）。APTT、PT、FIB是能夠反映凝血功能的指標，APTT 主要反映機體內源性凝血程度，PT 是反映凝血因子水平的外源性指標，并隨著膿毒癥疾病程度的升高而升高[20]。FIB 為干細胞合成及分泌的纖維蛋白，其表達水平升高可增加血栓發生的風險[21]。本研究發現，經過黃芩素干預后，膿毒癥組大鼠APTT、PT、FIB 的水平均有所降低，其中，黃芩素高劑量組降低作用明顯，與烏司他丁組比較，差異無統計學意義，表明黃芩素能有效改善膿毒癥大鼠的凝血紊亂情況，阻斷凝血-炎癥間相互促發的惡性循環。

綜上所述，黃芩素可改善膿毒癥大鼠靶器官肺損傷，其機制可能與抑制肺組織Caspase-1、Caspase-11蛋白表達，抑制細胞焦亡，進而減輕炎癥反應，并調節免疫應答及凝血功能有關。