槐定堿對肺腺癌細胞A549順鉑敏感性及miR-216a-5p/ZEB1軸的影響

聶佳， 李方， 李延波

（1.河北省中醫院呼吸內科，河北石家莊 050000；2.邯鄲市中心醫院腫瘤科，河北邯鄲 056000；3.邢臺市信都區人民醫院普通內科，河北邢臺 054001）

肺癌分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），其中，非小細胞肺癌占85%以上，主要包括腺癌、鱗狀細胞癌等。目前，臨床主要通過手術、放化療等多種手段治療，但患者總體生存率仍較低[1]。腫瘤細胞對抗癌藥物不敏感或容易產生耐藥是腫瘤化療效果不佳的原因[2]。提高化療敏感性，對于改善NSCLC患者生存質量、延長生存期、降低死亡率具有重要意義。中醫藥在治療肺癌方面具有潛在優勢，對放化療及分子靶向治療具有一定的增效作用，可不同程度地影響患者預后[3-5]。苦豆子為豆科植物苦豆子Sophora alopecuroidesL.的種子，具有清熱燥濕、止痛殺蟲等功效，槐定堿（sophoridine）是苦豆子中含量較高的生物堿之一，有抗病毒、調節免疫功能、抗心律失常、抗腫瘤等[6-11]多種藥理學作用。本研究以肺腺癌A549細胞為研究對象，觀察槐定堿對A549 細胞化療敏感性的影響，并探討其可能的作用機制，為槐定堿相關藥物開發應用于臨床抗腫瘤治療提供實驗依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系人肺腺癌A549 細胞株，購自中國科學院上海細胞中心。

1.2 藥物、試劑與儀器槐定堿（分子式：C15H24N2O；分子量：248.36），純度≥96.5%，成都曼斯特生物科技有限公司生產，批號：A0651；順鉑（cisplatin，合肥千盛生物科技有限公司生產，批號：200822）。RPMI-1640 培養基、胎牛血清（美國Gibco 公司）；抑制劑（miR-216a-5p inhibitor）、抑制劑陰性對照（inhibitor-NC）、miR-216a-5p 擬似物（miR-216a-5p mimic）、擬似物陰性對照（mimic-NC）（廣州銳博生物科技有限公司生產）；LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司）；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；兔抗人鋅指E 盒結合蛋白1（ZEB1）、B 細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）等抗體及山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）-辣根過氧化物酶（HRP）（英國Abcam 公司）。ELX800 全自動酶標儀（美國Biotek 公司）；實時熒光定量PCR 儀（美國Thermofisher 公司）；FACSCalibu 流式細胞儀系統（美國BD公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 細胞培養A549細胞常規復蘇后，接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基（100 U/mL 青霉素+100 mg/L 鏈霉素）中，5%CO2、37 ℃條件下培養，待細胞貼壁80%時進行傳代，每2 ～3 d 傳代1次，選取對數期細胞用于實驗。

1.4 槐定堿對A549細胞順鉑敏感性的影響

1.4.1 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測不同濃度槐定堿、順鉑處理后的細胞增殖能力 取對數生長期A549 細胞，0.25%胰蛋白酶消化，調整細胞密度為1×105/mL，接種于96孔板，24 h后吸去培養基，加入含有不同濃度槐定堿（10、20、40、80、160 μmol/L）、順鉑（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 nmol/L）的培養基，每個濃度設5 個復孔，同時設空白組（不加藥物）。24 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，繼續孵育4 h，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，充分振蕩10 min，酶標儀測定570 nm 波長處吸光度（OD）值。計算不同濃度槐定堿、順鉑干預后的細胞增殖抑制率，增殖抑制率=（1-不同濃度藥物組OD值/空白組OD值）×100%。根據結果，選取接近于20%抑制濃度（20% inhibitory concentration，IC20）的槐定堿和順鉑濃度進行后續實驗。

1.4.2 細胞分組與干預 取對數期A549 細胞，隨機分為對照組、槐定堿組、順鉑組和槐定堿+順鉑組。對照組常規培養；槐定堿組和順鉑組根據“1.4.1”項篩選的藥物濃度，分別加入40 μmol/L的槐定堿和2.0 nmol/L 的順鉑；槐定堿+順鉑組同時加入上述濃度的槐定堿和順鉑。繼續培養24 h。

1.4.3 平板克隆實驗檢測集落形成能力 取“1.4.2”項中各組細胞，調整細胞濃度為1×105/mL接種于6孔板，水平位置輕晃培養板，使細胞均勻分布，置于5%CO2、37 ℃條件下培養。每3 d更換一次培養基。2 周后，吸去培養基，PBS 清洗，每孔中加入200 μL 結晶紫，染色20 min，沖洗晾干，觀察集落數。

1.4.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集“1.4.2”項中各組細胞，1000 r/min（離心半徑8 cm）離心5 min，棄上清，將細胞吹打均勻，制備單細胞懸液，再次離心，加入400 μL 結合緩沖液重懸細胞。加入5 μL Annexin-FITC 混勻，避光室溫孵育15 min，加入10 μL PI，4 ℃避光孵育5 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，計算：細胞凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.5 槐定堿對A549細胞miR-216a-5p/ZEB1 軸的影響

1.5.1 細胞轉染與分組 取對數期A549 細胞，進行轉染。細胞轉染前1 d，調整密度為1 ×106/mL，接種于6孔板，待細胞融合達80%時，胰酶消化，收集細胞。隨機分為對照（control）組，抑制劑陰性對照（inhibitor-NC）組、抑制劑（inhibitor）組、槐定堿組、槐定堿+inhibitor-NC組、槐定堿+inhibitor組。control組常規培養，使用LipofectamineTM2000， 將miR- 216a- 5p inhibitor- NC 轉 染 至inhibitor-NC組和槐定堿+inhibitor-NC組細胞，將miR-216a-5p inhibitor轉染至inhibitor組和槐定堿+inhibitor組細胞，24 h 后，槐定堿組、槐定堿+inhibitor-NC組和槐定堿+inhibitor組分別加入40 μmol/L的槐定堿，繼續培養24 h。

1.5.2 實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）法檢測細胞中miR-216a-5p 和ZEB1 mRNA 表達 取“1.5.1”項中各組細胞，PBS 清洗，TRIzol 法提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA 260 nm和280 nm 處 光 密 度（OD）值，OD（260 nm）/OD（280 nm）為1.8 ～2.0 表示RNA 質量較好。反轉錄cDNA，進行定量PCR 擴增，反應體系：2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 加至20 μL。按照95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s 的反應程序，共進行40 個循環。根據2-ΔΔCt法計算miR-216a-5p mRNA 和ZEB1 mRNA 表達水平。實驗所用引物由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.5.3 雙熒光素酶報告基因系統驗證miR-216a-5p與ZEB1的靶向關系 利用TargetScan 7.2、miRanda等軟件預測miR-216a-5p 的下游靶基因，將ZEB1的3’UTR 區域野生型（wild type，wt）和突變型（mutant typ，mut）核苷酸序列分別構建至pGL3-basic載體報告基因Luciferase，構建熒光素酶質粒。取對數期A549 細胞，調整細胞密度為1×106/mL，接種于6 孔板，待細胞鋪滿約50%時，將wt ZEB1和mut ZEB1質粒載體，分別與miR-216a-5p mimic和miR-216a-5p mimic-NC 共轉染，孵育48 h。棄去培養基，裂解細胞，檢測螢火蟲熒光素酶活性和內參海腎熒光素酶活性，相對熒光素酶活性以二者比值表示。

1.5.4 Western Blot 法檢測細胞中ZEB1、Bcl-2、Bax 蛋白表達 收集“1.5.1”項中各組細胞，PBS清洗，加入200 μL蛋白提取液，冰上裂解30 min，12000 r/min（離心半徑8 cm）離心5 min，取上清，二喹啉甲酸（BCA）法檢測細胞蛋白濃度，制膠、上樣；進行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白，將蛋白轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜；TBST 溶液洗膜，加入5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h；TBST溶液洗膜，將膜放入稀釋后的ZEB1（1∶800）、Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）、GAPDH（1∶1000）一抗中，4 ℃孵育過夜；TBST溶液洗膜，將膜放入稀釋后的HRP 標記的二抗（1∶3000）中，室溫避光孵育2 h；TBST 溶液洗膜，加入電化學發光（ECL）發光液，室溫孵育1 min，進行顯色分析。應用ImageJ 軟件進行灰度值分析，以ZEB1、Bcl-2、Bax 蛋白灰度值與內參GAPDH灰度值比值表示其相對表達水平。

1.6 統計方法采用SPSS 24.0統計軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數± 標準差（x±s）表示。多樣本比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度槐定堿對A549細胞增殖能力的影響各濃度槐定堿作用后，A549 細胞增殖抑制率均較空白組升高，且隨著槐定堿濃度增加，A549細胞增殖抑制率增加（P＜0.05），表明不同濃度槐定堿對A549 細胞均有增殖抑制作用。具體結果見圖1。槐定堿作用于A549 細胞的IC20為38.56 μmol/L，故后續實驗選取接近IC20的濃度：40 μmol/L。

圖1 不同濃度槐定堿對A549細胞增殖能力的影響Figure 1 Effect of different concentrations of locustine on the proliferative capacity of A549 cells

2.2 不同濃度順鉑對A549細胞增殖能力的影響各濃度順鉑作用后，A549 細胞增殖抑制率均較空白組升高，且隨著順鉑濃度增加，A549 細胞增殖抑制率增加（P＜0.05），表明不同濃度順鉑對A549細胞均有增殖抑制作用。具體結果見圖2。順鉑作用于A549 細胞的IC20為1.93 nmol/L，故后續實驗選取接近IC20的濃度：2.0 nmol/L。

圖2 不同濃度順鉑對A549細胞增殖能力的影響Figure 2 Effect of different concentrations of cisplatin on the proliferative capacity of A549 cells

2.3 槐定堿對順鉑處理的A549 細胞集落形成的影響對照組、槐定堿組、順鉑組和槐定堿+順鉑組細胞集落數分別為（336.26 ± 23.15）、（172.15 ±18.19）、（162.57 ± 16.23）、（96.58 ± 13.64）個。與對照組比較，槐定堿組、順鉑組和槐定堿+順鉑組細胞集落數均減少（P＜0.05）；槐定堿+順鉑組細胞集落數少于槐定堿組和順鉑組（P＜0.05）。表明槐定堿可增強順鉑對A549 細胞集落形成的抑制作用。結果見圖3。

圖3 各組平板克隆實驗結果Figure 3 Results of plate cloning experiments for each group

2.4 槐定堿對順鉑處理的A549 細胞凋亡的影響對照組、槐定堿組、順鉑組和槐定堿+順鉑組細胞凋亡率分別為：（2.34 ± 0.79）%、（12.15 ±1.26）%、（15.74±1.35）%、（22.68±1.57）%。與對照組比較，槐定堿組、順鉑組和槐定堿+順鉑組細胞凋亡率均升高（P＜0.05）；槐定堿+順鉑組細胞凋亡率高于槐定堿組和順鉑組（P＜0.05）。表明槐定堿可增強順鉑對A549 細胞的促凋亡作用。結果見圖4。

圖4 各組A549細胞凋亡的流式散點圖Figure 4 Flow cytometry scatter plot for A549 cell apoptosis in each group

2.5 槐定堿對A549 細胞中miR-216a-5p、ZEB1 mRNA 表達的影響與control組和inhibitor-NC組比較，inhibitor組miR-216a-5p 表達水平降低，ZEB1 mRNA表達水平升高（均P＜0.05）；與control組比較，槐定堿組miR-216a-5p 表達水平升高，ZEB1 mRNA表達水平降低（均P＜0.05）；與inhibitor組比較，槐定堿+inhibitor組miR-216a-5p 表達水平升高，ZEB1 mRNA 表達水平降低（均P＜0.05）；與槐定堿組、槐定堿+inhibitor-NC組比較，槐定堿+inhibitor組miR-216a-5p 表達水平降低，ZEB1 mRNA表達水平升高（均P＜0.05）。表明下調A549細胞中miR-216a-5p 可促進ZEB1 mRNA 表達，而槐定堿可減弱下調miR-216a-5p 對ZEB1 mRNA 表達的促進作用。具體結果見表2。

表2 各組A549細胞中miR-216a-5p、ZEB1 mRNA表達水平比較Table 2 Comparison of expression levels of miR-216a-5p and ZEB1 mRNA among various groups of A549 cells （±s，n=5）

表2 各組A549細胞中miR-216a-5p、ZEB1 mRNA表達水平比較Table 2 Comparison of expression levels of miR-216a-5p and ZEB1 mRNA among various groups of A549 cells （±s，n=5）

①P＜0.05，與對照（control）組比較；②P＜0.05，與抑制劑陽性對照（inhibitor-NC）組比較；③P＜0.05，與抑制劑（inhibitor）組比較；④P＜0.05，與槐定堿組比較；⑤P＜0.05，與槐定堿+inhibitor-NC組比較

組別control組inhibitor-NC組inhibitor組槐定堿組槐定堿+inhibitor-NC組槐定堿+inhibitor組F值P值miR-216a-5p 1.01±0.121.02±0.100.13±0.05①②1.79±0.14①1.82±0.16②④1.18±0.11③④⑤172.459＜0.001 ZEB1 mRNA 1.02±0.111.01±0.122.59±0.18①②0.35±0.06①0.33±0.05②④1.76±0.15③④⑤335.621＜0.001

2.6 雙熒光素酶實驗轉染miR-216a-5p mimic可明顯降低ZEB1 wt 相對熒光素酶活性（P＜0.05），而對ZEB1 mut 相對熒光素酶無顯著性影響（P＞0.05），表明miR-216a-5p 可靶向調控ZEB1 的表達。具體結果見圖5。

圖5 miR-216a-5p與ZEB1的靶向關系Figure 5 The targeting relationship between miR-216a-5p and ZEB1

2.7 槐定堿對A549 細胞ZEB1、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響與control組和inhibitor-NC組比較，inhibitor組ZEB1、Bcl-2 蛋白表達水平升高，Bax蛋白表達水平降低（均P＜0.05）；與control組比較，槐定堿組ZEB1、Bcl-2 蛋白表達水平降低，Bax蛋白表達水平升高（均P＜0.05）；與inhibitor組比較，槐定堿+inhibitor組ZEB1、Bcl-2 蛋白表達水平降低，Bax 蛋白表達水平升高（均P＜0.05）；與槐定堿組、槐定堿+inhibitor-NC組比較，槐定堿+inhibitor組ZEB1、Bcl-2 蛋白表達水平升高，Bax 蛋白表達水平降低（均P＜0.05）。表明下調A549 細胞中miR-216a-5p 可促進ZEB1 蛋白表達，抑制細胞凋亡，而槐定堿可減弱miR-216a-5p 表達下調所致的抑凋亡作用。具體結果見表3、圖6。

圖6 各組A549細胞中ZEB1、Bcl-2、Bax的Western Blot電泳圖Figure 6 Western Blot electrophoretogram of ZEB1，Bcl-2 and Bax in various groups of cells

表3 各組細胞中ZEB1、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較Table 3 Comparison of relative protein expression of ZEB1，Bcl-2 and Bax amongvarious groups of cells （±s，n=5）

表3 各組細胞中ZEB1、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較Table 3 Comparison of relative protein expression of ZEB1，Bcl-2 and Bax amongvarious groups of cells （±s，n=5）

①P＜0.05，與對照（control）組比較；②P＜0.05，與抑制劑陽性對照（inhibitor-NC）組比較；③P＜0.05，與抑制劑（inhibitor）組比較；④P＜0.05，與槐定堿組比較；⑤P＜0.05，與槐定堿+inhibitor-NC組比較

組別control組inhibitor-NC組inhibitor組槐定堿組槐定堿+inhibitor-NC組槐定堿+inhibitor組F值P值ZEB1蛋白相對表達量0.78±0.080.76±0.071.16±0.12①②0.15±0.04①0.17±0.04②④0.89±0.07③④⑤179.523＜0.001 Bcl-2蛋白相對表達量0.82±0.080.80±0.071.19±0.10①②0.21±0.06①0.23±0.05②④0.97±0.09③④⑤183.259＜0.001 Bax蛋白相對表達量0.43±0.060.45±0.050.16±0.04①②1.07±0.09①1.05±0.05②④0.31±0.05③④⑤211.467＜0.001

3 討論

非小細胞肺癌（NSCLC）發病機制復雜，與基因突變、細胞信號通路傳導改變及新生血管異常等多種因素有關，手術切除不能完全治愈，且術后腫瘤易發生轉移、復發，患者5年生存率仍較低[12]。通過化療輔助治療NSCLC，可在一定程度上減少腫瘤復發和轉移。以順鉑為基礎的化療是延長患者生存期的主要手段之一，順鉑可抑制腫瘤細胞DNA 復制和RNA 合成，阻止細胞有絲分裂，抑制細胞增殖和誘導凋亡；然而化學耐藥性已成為制約鉑類藥物充分發揮治療效果的主要原因[13]。近年來，國內外學者開始從天然產物及其衍生物中尋找有效的抗腫瘤方法。大量實驗結果表明，部分中藥單體聯合放化療可產生增效或減毒效應[14-15]。本研究選擇中藥苦豆子主要生物堿成分槐定堿作用于順鉑處理的人肺腺癌A549 細胞株，探討其能否提高細胞的化療敏感性。結果表明，槐定堿可增強順鉑對A549 細胞的增殖抑制和誘導凋亡作用，提示其可提高肺腺癌細胞對化療的敏感性。

另外，有研究證實，miRNA 有調節腫瘤細胞耐藥性和敏感性的作用[16]。miR-216a-5p與多種腫瘤關系密切，在不同腫瘤中的作用不盡相同。體外細胞實驗證實，miR-216a-5p mimic 可促進腎細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲[17]，而miR-216a-5p抑制劑則發揮相反作用[18]。Zhang 等[19]研究發現，miR-216a-5p 在胰腺癌組織和細胞系中明顯下調，低表達的miR-216a-5p 可促進胰腺癌細胞生長和腫瘤進展。國內外研究均報道，下調miR-216a-5p表達可促進肺癌細胞增殖和侵襲[20-21]。為進一步闡明槐定堿抗肺腺癌的作用機制，本研究轉染miR-216a-5p inhibitor 至A549 細 胞 后，A549 細 胞 中miR-216a-5p 表達較control組和inhibitor-NC組明顯下降，而槐定堿組miR-216a-5p 表達較control組和inhibitor-NC組明顯升高，表明槐定堿可上調miR-216a-5p 表達。轉染miR-216a-5p inhibitor 后繼續使用槐定堿處理A549 細胞，細胞中miR-216a-5p上調趨勢被抑制，表明槐定堿參與調控肺腺癌細胞miR-216a-5p的表達。miR-216a-5p可通過調控下游靶基因發揮相關生物學作用。本研究經雙熒光素酶實驗證實ZEB1 是miR-216a-5p 的下游靶基因，進一步觀察槐定堿對A549 細胞ZEB1、Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響，結果表明，槐定堿上調miR-216a-5p表達時，使ZEB1、Bcl-2蛋白表達下降，Bax蛋白表達升高，提示槐定堿可能通過上調miR-216a-5p 表達，靶向降低ZEB1 表達，調控A549 細胞凋亡相關蛋白表達，起到抑制肺腺癌的作用。

綜上所述，本研究初步證實槐定堿對A549 細胞具有一定的增殖抑制及促凋亡作用，并可提高A549 細胞對順鉑的敏感性，還可通過上調miR-216a-5p 靶向下調ZEB1 表達，調控凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax 等表達，進而發揮抗肺腺癌的作用。但本研究僅采用體外實驗檢測槐定堿的藥理學功效，今后有待進行體內實驗驗證其靶向抗腫瘤作用及安全性。