cid-miR-146a在LCDV-cn感染中的差異表達及其調控作用

胡海浩，黃鑒濤，馬嘉霖，楊 碩，閆秀英，簡紀常

（廣東海洋大學水產學院/廣東省水產動物病害防控與健康養殖重點實驗室/水產經濟動物病害控制廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524088）

魚淋巴囊腫病毒中國株（Lymphocystis disease virus China,LCDV-cn）是牙鲆（Paralichthys olivaceus）淋巴囊腫病的病原[1]，致使患魚在皮膚、鰭、尾部等長有囊腫，給牙鲆養殖造成了重大損失。對LCDVcn 及牙鲆淋巴囊腫病的研究已取得一定進展[2-6]，但牙鲆淋巴囊腫病的有效防控依然是水產養殖業中的難題，其原因之一是LCDV-cn 的致病機制知之甚少[7]。微小RNA（miRNA）可通過與靶基因結合對靶基因的轉錄進行調控，從而參與多種病理、生理過程[8]。因此，對LCDV-cn 感染過程中miRNA 的調控作用進行研究，可在miRNA 層面解析LCDV-cn的致病機制。

研究發現不同物種miR-146a的序列高度保守，提示miR-146a在生物體的生理、病理過程中可能發揮重要作用[8]。已有研究表明miR-146a在多種腫瘤中高度表達，調控腫瘤發生發展的許多生物學過程，而且miR-146a 的調控具有促腫瘤發展的作用，抑制miR-146a 的表達可使腫瘤細胞的致瘤性和侵襲力下降[9-10]。更有研究表明miR-146a 調控病毒的感染過程，如在乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染過程中，miR-146a 通過抑制機體抗病毒反應促進HBV 復制和蛋白表達[11]；丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）感染可誘導miR-146a 的表達上調，從而促進病毒感染[12]；在人乳頭瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）感染中，miR-146a 發揮多重作用，調控HPV 的感染進展[13]；還有研究發現，miR-146a 的上調與EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染引起的腫瘤細胞增殖相關[14-15]、有些病人miR-146a 的下調可能與新型冠狀病毒（Corona covid-19 virus，COVID-19）感染引起的嚴重癥狀有關[16]、miR-146a 可調控人類免疫缺陷病毒（Human immunodefdiciency virus type 1,HIV-1）感染[17]、miR-146a 的表達上調可促進石斑魚虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）感染[18]，等。上述研究表明miR-146a 在病毒感染和腫瘤發生中起著重要的調控作用。

本課題組前期研究[19]表明，草魚miR-146a（Ctenopharyngodon idellamiR-146a，cid-miR-146a）在LCDV-cn 感染草魚卵巢細胞系（grass carp ovary cells，GCO）過程中存在顯著差異表達。因此，本研究在LCDV-cn感染GCO 過程中，對cid-miR-146a進行鑒定和表達特性分析，并探索cid-miR-146a 的調控作用，為在miRNA 層面解析LCDV-cn 的致病機制等提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LCDV-cn 分離自患淋巴囊腫病的牙鲆，保存于本實驗室；GCO細胞購買于深圳檢驗檢疫局。

本研究所用引物見表1，在上海生工生物技術有限公司合成。

1.2 LCDV-cn感染GCO細胞

用25 cm2細胞培養瓶于28 ℃培養GCO 細胞，具體操作參照文獻[2,19]，所用培養基為MEM 培養基[含體積分數10%胎牛血清（FBS）]，正常傳代約48 h 單層細胞鋪滿瓶底時，吸出培養液，取1 mL 的LCDV-cn 懸液（滴度濃度105.5TCID50/mL[19]）進行感染（同時設未感染組為對照組），于20 ℃下孵育1 h后，取出病毒懸液，加入4 mL 維持液（含體積分數2%FBS 的MEM 培養基）于20 ℃下繼續感染實驗，并定時取樣。

1.3 電鏡負染

取10 mL 滴度濃度（105.5TCID50/mL）的LCDV-cn懸液[19]，于室溫和-80 ℃反復凍融4 次，于4 ℃、1 000g條件下離心30 min，取上清用質量分數3%磷鎢酸進行染色，于廣東醫科大學附屬醫院進行電鏡觀察。

1.4 頸環（Stem-loop）RT-PCR

取LCDV-cn感染GCO 72 h時樣品1瓶（細胞培養瓶），胰酶消化后取1×106個細胞，于室溫、1 000g條件下離心3 min，棄上清后，加入1 mL Trizol，按照TRIzol?LS試劑盒說明書提取RNA，并用10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。用提取的RNA和頸環反轉錄引物RT-cid-miR-146a（表1），按照反轉錄試劑盒PrimeScript?RTreagent Kit with gDNA Eraser 說明書進行特異性反轉錄，制備頸環RT-PCR模板cDNA，保存于-80 ℃備用。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

根據前期研究結果[19]，采用頸環RT-PCR 擴增cid-miR-146a，所用引物cid-miR-146a-F 和cid-miR-146a-R 見表1。PCR 擴增體系為50 μL，包含EX-Taq 25 μL、cDNA 3 μL（質量濃度約為50 μg/mL）、cid-miR-146a-F 2 μL、cid-miR-146a-R 2 μL 和ddH2O 18 μL。PCR 反應條件為95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，循環40 次。然后用3%（質量體積比）瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。頸環RT-PCR 擴增獲得目的片段的長度為60 bp，包括上游序列4 bp（5′-GCGC-3′）、cid-miR-146a序列23 bp（5′-TGAGA ACTGAATTCCATAGATGG-3′）、頸環序列33 bp（5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATC GAC-3′）。將cid-miR-146a 插入至pMD18-T 載體，然后轉化至DH5α，于37 ℃下進行培養。按藍白斑篩選方法選取陽性菌落[1]，并將陽性菌落送往上海生工生物技術有限公司進行測序。

1.5 定量PCR

收集LCDV-cn 感染GCO 細胞后0、4、8、16、24、48、72、144 和196 h 樣品，然后制備cDNA（同前）用于定量PCR。所用引物cid-miR-146a-F、cid-miR-146a-R、U6F和U6R見表1，定量PCR總體積為10 μL，包含TB Green Premix Ex Taq II 5 μL、cDNA 1 μL、cid-miR-146a-F 1 μL、cid-miR-146a-R 1 μL 和ddH2O 2 μL。反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，循環40次。

上調下調實驗中，cid-miRNA-146a 在GCO 細胞的表達定量。上調下調實驗包括4 組：上調組（轉染cid-miR-146a mimics 模擬物，轉染濃度為20 nnmol/L）、下調組（轉染cid-miR-146a inhibitor 抑制物，轉染濃度為20 nnmol/L）、陰性對照（NC組：轉染NC，轉染濃度為20 nnmol/L，）和陽性對照（LCDV-cn 正常感染組，無轉染）。cid-miR-146a mimics、cid-miR-146a inhibitor 和NC的序列分別為5′-UGAGAACUGAAUUCCAUAGAUGG-3′、5′-CCAUCUAUGGAAUUCAGUUCUCA-3′和5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′，于上海生工生物技術有限公司合成。用不含抗生素的MEM（含體積分數10%FBS）培養GCO細胞，當GCO細胞于12～16 h 單層生長至70%～90%時，使用Lipo‐fectamineTMRNAiMAX 將cid-miR-146a mimics、cidmiR-146a inhibitor 和NC 分別轉染至GCO 細胞，培養24 h后，用LCDV-cn進行感染，于20 ℃繼續培養。然后，收集LCDV-cn 感染GCO 細胞0、4、8、16、24、48、72、144 和196 h 樣品，制備cDNA 用于cid-miR‐NA-146a 的定量。定量PCR 所用引物、定量PCR 體系和反應條件同上述cid-miRNA-146a的表達定量。

cid-miRNA-146a 靶基因Flt1的表達定量。樣品制備同上述上調下調實驗。定量PCR 所用引物RT-Flt-F、RT-Flt-R、18s-F 和18s-R 見表1，定量PCR體系和反應條件同上述cid-miRNA-146a 的表達定量。

根區溫度對嫁接黃瓜苗葉綠素熒光參數的影響…………………………… 劉念奇，宋 陽，孫世君，高 宇，吳佳旺，崔曉晗（118）

LCDV-cnmcp（主要衣殼蛋白，major capsid protein）的表達定量（代表LCDV-cn 的復制[7]）。樣品制備同上述上調下調實驗。定量PCR 所用引物RT-LCDV-MCP-F、RT-LCDV-MCP-R、18s-F 和18s-R見表1，定量PCR 體系和反應條件同上述cid-miR-146a的表達定量。

1.6 統計分析

應用SPSS 24 軟件，用2-ΔΔCt法[23]進行單因素方差分析，并統計差異顯著與否（P<0.05或P<0.01）。

1.7 cid-miR-146a靶基因預測

應用RNAhybrid（https://bibiserv.cebitec.unibielefeld.de/rnahybrid/）、miRanda（http://www.microrna.org/）和TargetScan（http://www.targetscan.org/fish_62/）軟件預測cid-miR-146a的靶基因。3 個軟件預測到的共同靶基因作為靶向目標進行后續研究。

1.8 雙熒光素酶系統驗證cid-miR-146a的靶基因

應用RNA22 預測cid-miR-146a 靶基因的靶位點，根據靶位點設計擴增靶基因片段的引物為pmirGLO-Flt1-F和pmirGLO-Flt1-R（表1）。RT-PCR總體積為50 μL，包含ExTaq?酶25 μL、pmirGLOFlt1-F 2 μL、pmirGLO-Flt1-R 2 μL、cDNA 3 μL、ddH2O 18 μL。PCR 反應條件為95 ℃3 min；95 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃1 min，35 個循環；最后72 ℃延伸5 min。將PCR 產物與pMD18-T 載體連接，進行亞克隆。通過菌落PCR（引物見表1）和測序進行驗證。將驗證正確的靶基因片段插入至雙熒光素酶啟動子pmirGLO 載體上，構建pmirGLO-Flt1 載體，并進行亞克隆。通過菌落PCR和測序進行驗證。將正確構建的pmirGLO-Flt1載體分別與cid-miR-146a mimics、cid-miR-146a inhibitor 和NC 共轉染至GCO細胞，于20 ℃培養48 h，檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.9 生物信息學方法預測cid-miR-146a調控LCDV-cn感染的信號通路

應 用GO（http://geneontology.org/）和KEGG（https://www.genome.jp/kegg/）數據庫對cid-miR-146a可能參與的信號通路進行富集分析。

2 結果與分析

2.1 LCDV-cn感染GCO細胞的過程

LCDV-cn感染GCO細胞后，呈現的細胞病變效應（cytopathic effect,CPE）與文獻[2]一致。LCDVcn 感染GCO 細胞后3 d，細胞聚集、呈現明顯的“疤痕”現象，“疤痕”一直持續到約感染后6 d，6 d 之后細胞逐漸脫落、裂解，出現空洞（圖1）。

圖1 LCDV-cn感染GCO細胞Fig.1 GCO cells challenged with LCDV-cn

2.2 感染用LCDV-cn懸液電鏡負染

LCDV-cn 以滴度濃度105.5TCID50/mL[19]進行后續感染實驗，感染用病毒懸液進行電鏡負染可看到病毒粒子（直徑約110 nm）（圖2）。

圖2 感染用LCDV-cn懸液電鏡負染Fig.2 Electron microscope of negative staining with LCDV-cn suspension for infection

2.3 cid-miR-146a的擴增

電泳結果表明28S、18S和5S rRNA條帶完整清晰(圖3)，說明提取的樣品總RNA 無降解，可用于后續實驗。頸環RT-PCR 擴增后，電泳檢測表明獲得目的片段（圖4(a)）。經菌落PCR（圖4(b)）和測序驗證獲得的片段是正確的，即為cid-miR-146a。cidmiR-146a 的序列為5′-UGAGAACUGAAUUCCAU‐AGAUGG-3′（23 bp），經序列比對發現，cidmiR-146a與其他物種miR-146a同源（表2）。

表2 已知的miR-146a序列Table 2 Known miR-146a sequences

圖3 提取的樣品總RNAFig.3 Extracted total RNA of samples

圖4 cid-miR-146a頸環RT-PCR和菌落PCRFig.4 Stem-loop RT-PCR and colony PCR of cid-miR-146a

2.4 cid-miR-146a 在LCDV-cn 感染GCO中的表達特性

依據LCDV-cn 感染GCO 細胞出現CPE 現象的變化特點，選取LCDV-cn 感染后0、4、8、16、24、48、72、144和196 h樣品，進行差異表達分析。由圖5可知，從0 到72 h，cid-miR-146a 的表達量逐漸增加，144和196 h時cid-miR-146a的表達量下降。

圖5 cid-miR-146a在LCDV-cn感染GCO過程中的表達Fig.5 Expression of cid-miR-146a in GCO cells infected with LCDV-cn

2.5 cid-miR-146a靶基因的預測

RNAhybrid 預測到cid-miR-146a 的靶基因為Gimap8（GTP 酶免疫相關蛋白8，GTPase immuneassociated protein 8）、LEPR（瘦素受體，leptin receptor）、Flt1（Fms 相關酪氨酸激酶1，Fms-related tyrosine kinase 1）和DLGAP5（Discs 大同源相關蛋白5，Discs large homologous affinity protein 5），其總評分值分別為-0.41、-0.01、-0.32和-0.046（評分值為負數，靶基因的概率大）。miRanda 預測到cid-miR-146a 的靶基因為PDIA3（蛋白質二硫鍵異構酶A3,protein disulfide-isomerase A3）、irak1（細胞介素-1受體相關激酶-2）、LOX（賴氨酰氧化酶，lysyl oxidase）和Flt1（Fms 相關酪氨酸激酶1，Fms-related tyrosine kinase 1），其總評分值分別為-0.013、-0.046、-0.19和-0.31。TargetScan 預測到cid-miR-146a 的靶基因為DIO-1（碘代甲狀腺氨酸脫碘酶1，iodothyronine deiodinase 1）、Flt1（Fms 相關酪氨酸激酶1，Fmsrelated tyrosine kinase 1）和Gimap8（GTP酶免疫相關蛋白8，GTPase immune-associated protein 8），其總評分值分別為-0.18、-0.32和-0.41。預測到的靶基因與癌癥和腫瘤發生、抗原呈遞和感染反應相關。

此3 個軟件均預測到Flt1是cid-miR-146a 的靶基因，因此后續以Flt1為靶標開展實驗。應用RNA22 預測到Flt1含有 結合cid-miRNA-146a 的位點（折疊能為-72.38 kJ/mol，P值為0.353），Flt1與cid-miRNA-146a 結 合 的 位 點 序 列 為：5′-UACA‐AAAGGGAGGUUCAGUUCUC-3′（圖6），位于Flt1mRNA（GenBank 編碼：XM_039667029）的280-302堿基（圖6）。

圖6 cid-miR-146a靶向Flt1基因的結合位點Fig.6 Binding sites of the gene Flt1 targeted with cid-miR-146a

2.6 cid-miR-146a的靶基因Flt1驗證

選取含靶位點的Flt1片段，其長度為456 bp，位于Flt1mRNA 的249-704 堿基。經RT-PCR 擴增后將目的Flt1片段插入至pmirGLO 載體，菌落PCR、XhoⅠ和SalⅠ雙酶切（圖7）和測序結果說明目的片段是正確的，成功構建pmirGLO-Flt1，并應用雙光素酶報告基因系統驗證靶基因。雙熒光素酶報告系統檢測雙熒光素酶的活性結果顯示（圖8）：共轉染cid-miR-146a mimics 和pmirGLO-Flt1 后，雙熒光素酶活性顯著下降，并與其它兩組（共轉染cid-miR-146a inhibitor 或NC）差異顯著（P<0.05），表明Flt1確實是cid-miR-146a的靶基因。

圖7 pmirGLO-Flt1雙酶切Fig.7 Double enzyme digestion of pmirGLO-Flt1

圖8 雙熒光素酶活性檢測Fig.8 Detection of luciferase activity

2.7 cid-miR-146a在上調下調GCO細胞中的表達量

對cid-miR-146a 進行上調下調后，定量PCR 結果表明（圖9）：在cid-miR-146a 上調和下調的GCO細胞中，cid-miR-146a 的表達量與陽性對照組和陰性對照組中的表達量存在顯著差異（P<0.05）；cidmiR-146a 上調組中，cid-miR-146a 的表達量明顯升高（P<0.05），而在cid-miR-146a 下調組中，cid-miR-146a 的表達量明顯下降（P<0.05）。由此也說明轉染cid-miR-146a mimics 和cid-miR-146a inhibitor 的濃度20 nnmol/L 是合適的，后續研究按此濃度20 nnmol/L進行。

圖9 上調下調實驗中cid-miRNA-146a在GCO細胞的表達Fig.9 Expression of cid-miRNA-146a in GCO cells for the up-down regulation experiment

2.8 cid-miR-146a對其靶基因Flt1的調控

對cid-miR-146a 進行上調下調后，靶基因Flt1定量PCR 結果表明（圖10）：在cid-miR-146a 上調組，Flt1的表達量最少，與其它組的表達量存在顯著差異（P<0.05）；在cid-miR-146a下調組，Flt1的表達量最多，與其它組的表達量存在顯著差異（P<0.05）；在陽性對照組，Flt1的表達量先下降然后上升，在72和144 h時最少。

圖10 GCO細胞中Flt1的表達Fig.10 Expression of the gene Flt1 in GCO cells

2.9 cid-miRNA-146a對LCDV-cn復制的調控

對cid-miR-146a 進行上調下調后，LCDV-cnmcp基因定量PCR 結果（mcp的表達代表LCDV-cn的復制）表明（圖11）：在cid-miR-146a 上調組，mcp基因的表達量最多，峰值在72 h，與其它組的表達量差異顯著（P<0.05）；在cid-miR-146a下調組，mcp基因的表達量最少，與其它組的表達量差異顯著（P<0.05）；在陽性對照組（LCDV-cn 正常感染），mcp基因的表達量先上升后下降，與上調組趨勢一致，峰值在72 h。由此說明，cid-miR-146a 上調促進LCDV-cn 在GCO 細胞的復制，cid-miR-146a 下調后LCDV-cn在GCO細胞的復制降低。

圖11 GCO細胞中mcp基因的表達Fig.11 Expression of the mcp gene in GCO cells

2.10 生物信息學預測cid-miR-146a 在LCDV-cn 感染過程中調控的信號通路

應用GO 和KEGG 預測到cid-miR-146a 調控的信號通路可能包括Toll樣受體（Toll-like receptor）信號通路（P值為0.005 6）、NF-кB（nuclear factor κB）信號通路（P值為0.009 4）和ErbB（receptor tyrosine kinases）信號通路（P值為0.0266 7）等。Toll 樣受體可識別病原體、快速激活先天免疫，NF-кB可調節涉及免疫、細胞存活等的基因，ErbB 可調控細胞增殖、分化和存活等（https://www.genome.jp/kegg/）。

3 討論

miRNA 在病毒感染和腫瘤發生中起著重要的調控作用，miR-146a 作為不同生物中比較保守的miRNA，已成為抗病毒感染和抗腫瘤等研究的熱點[9-18]。高通量測序表明在LCDV-cn感染GCO 過程中，cid-miR-146a 的表達存在顯著差異[19]，本研究以cid-miR-146a 為目標miRNA，探索cid-miR-146a 對其靶基因和LCDV-cn復制的調控作用。

LCDV-cn 感染GCO 后的CPE 現象呈現出“疤痕”和空洞，與Zhang等[2]的研究一致。在本研究中，LCDV-cn 感染GCO 后CPE 現象的變化與cid-miR-146a的表達變化時間點呈正相關：在LCDV-cn 感染GCO 后，細胞聚集“疤痕”形成的過程（圖2），cidmiR-146a 的表達一直上調（圖4）；細胞脫落、裂解、“疤痕”消失的過程（圖2），cid-miR-146a的表達下調（圖4）。總之，在LCDV-cn 感染GCO 細胞過程中，cid-miR-146a的表達先上升（3 d前）后下降（6 d后）。在病毒感染的不同時期，cid-miR-146a 呈先上調后下調的表達模式，這在其它病毒感染中也得以發現，如，在HPV感染中，在感染的起始階段miR-146a表達上調，在感染后期miR-146a表達下調[13]。

本研究表明cid-miR-146a靶向Fms相關酪氨酸激酶1 (FLT1)的編碼區而發揮其調控作用。FLT1是血管內皮生長因子（VEGF）受體之一，Flt1廣泛表達于腫瘤細胞，與血管生成和腫瘤發生相關[24]。在本研究中，LCDV-cn 感染后引起的淋巴囊腫病是一種皮膚瘤（可自愈），在較大的囊腫上有肉眼可見的紅色血管[25]，說明在LCDV-cn 引起的皮膚瘤發展過程中確實存在著血管生成。研究表明在多種腫瘤中Flt1的表達異常，如，在神經膠質瘤中Flt1的表達高度上調[24]、在頭頸鱗狀上皮細胞癌中Flt1選擇性上調表達[26]等。本研究發現在LCDV-cn 感染GCO細胞過程中，cid-miR-146a 對其靶基因Flt1的表達起著負調控作用（圖10），與HPV 感染中miR-146a的調控相似。在HPV 感染引起的腫瘤中，miR-146a靶向調控表皮生長因子受體（EGFR），且miR-146a負調控EGFR的表達[27]。在其它一些腫瘤研究中，也發現了miRNA 對Flt1的負調控作用，如，miR-139-5p 靶向Flt1抑制Flt1的表達，從而調控人類神經膠質瘤的發展[24]。此外，研究發現降低或抑制Flt1的表達可控制腫瘤的發展等：乳腺癌中Flt1的抑制可以降低腫瘤轉移效率[28]，敲降Flt1的表達可以阻止膠質瘤細胞的傳播[29]，在絨膜癌細胞中Flt1基因是特定類型細胞腫瘤的抑制劑[30]。而且，血管生成對腫瘤發展來說是必不可少的，FLT1是血管生成和腫瘤發生的主要調控因子之一[24,31]，因此，Flt1已成為一種新型潛在的腫瘤治療靶點[28-29]。雖然本研究表明cid-miR-146a對Flt1的表達起著負調控作用，但其對LCDV-cn感染的調控機制有待深入研究。

本研究結果進一步表明LCDV-cn的復制與cidmiR-146a 的表達呈正相關（圖11），隨著cid-miR-146a 的上調下調而變化。在其它病毒感染中，也發現miR-146a的表達與病毒復制呈正相關，并促進病毒復制。如，miR-146a 促進HBV 的復制，可提高HBV 引起肝癌的風險[32-33]。此外，目前研究表明在病毒感染中，miR-146a 調控免疫相關等信號通路，從而調控病毒的復制。如，在流感病毒H1N1 和H3N2 感染中，miR-146a 參與的信號通路包括Toll樣受體信號通路、先天免疫反應、細胞因子的產生和凋亡[34]；在EBV 感染過程中，miR-146a 參與淋巴細胞信號通路和干擾素信號通路等[35]。本研究應用生物信息學方法預測到cid-miR-146a可能參與調控Toll 樣受體信號轉導通路、NF-кB 信號通路和ErbB信號通路，這些信號通路與免疫和腫瘤發生相關。因此，推測cid-miR-146a 調控的LCDV-cn 致病機制可能涉及與宿主免疫因子的互作、腫瘤發生發展等，cid-miR-146a 對LCDV-cn 感染的調控機制還有待深入研究。本研究還發現Flt1的表達與LCDVcn 的復制呈負相關，但Flt1對LCDV-cn 復制的調控機制有待解析。