一株微藻附生菌的分離鑒定及藻菌體系的氮吸收特性

陳永志，黃翔鵠，朱春華，莫 峰，溫其交，張玉蕾

（1.廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088;2.廉江市養蝦集團有限公司，廣東 湛江 524499）

水產養殖水體往往殘留大量的氮，主要以氨氮（NH4+-N）、亞硝酸鹽氮（NO2–-N）、硝酸鹽氮（NO3–-N）和有機氮的形式存在[1]。微藻在利用CO2進行光合作用的同時可從環境中吸收利用N、P 等物質[2]，對水質有一定調控作用。藻細胞生存環境中存在大量微生物，藻菌相互作用形成藻際環境：藻光合作用可向環境釋放碳源等有機物，細菌吸收這些物質進行自身生長繁殖，產生的無機鹽等物質釋放到環境中又可被藻吸收利用[3-5]，微藻為細菌提供可附著棲息地，并通過釋放胞外產物促進細菌生長，確保細菌的生長環境有利且穩定；細菌對氧氣的消耗可緩解氧氣對微藻的抑制作用，增強藻類生命活動，促進對水環境中氮磷等營養鹽的吸收[6-8]。由微藻與細菌組成的體系可更有效吸收水中的氮、磷等污染物，比單一微藻在水環境調控方面效果更佳[9]，有效率高、成本低、二次污染小的特點，有較好的應用前景。利用小球藻（Chlorellasp.）、隱藻（Cryp‐tophytasp.）與污水細菌的藻菌體系比純藻體系對氮磷去除效果更佳，藻生物量更大[10]；在高溫、高鹽和強光環境中，側孢短芽孢桿菌（Brevibacillus lat‐erosporus）和威氏海鏈藻（Thalassiosira weissflogii）構建的藻菌體系可有效吸收對蝦池塘中過量的氨氮[11]；固定化的蛋白核小球藻（Chlorella pyre‐noidosa）和光合細菌對PO43–-P 和NH4+-N 的去處效果顯著高于二者單獨培養體系[12]。但是，Kato 等[13]從沿海海水分離的一株單胞菌會分泌物質抑制骨條藻（Skeletonemasp.）的生長；當某些細菌增多時，會與藻類在營養物質上形成競爭[14]。因此，利用藻菌互利共生關系，構建合理并有特定功能的藻菌體系，是生物法調控養殖水環境的一個重要環節。波吉卵囊藻（Oocystis borgei）是廣泛分布于對蝦養殖池塘、河口等水域的綠藻，有廣溫廣鹽性，其種群增長穩定，在對蝦養殖池塘的中后期可成為優勢種，能穩定池塘水質，已廣泛應用于對蝦養殖水環境調控[15-16]。本研究擬從波吉卵囊藻藻際環境中分離、鑒定附生細菌，構建分離細菌與波吉卵囊藻的藻菌體系，研究該體系的氮吸收特性，為藻菌體系在水生態環境調控上的應用研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

波吉卵囊藻由廣東海洋大學藻類資源開發與養殖環境生態修復實驗室提供，培養于改良的f/2海水培養基；使用2216E 固體培養基進行菌株分離純化和菌落形態觀察，使用2216E 液體培養基進行菌株的活化及培養。

收集培養7 d 的波吉卵囊藻藻細胞，用無菌海水適當稀釋，采用涂布平板法將藻液接種于2216E固體培養基，于恒溫培養箱中30 ℃無光倒置培養，挑出優勢單菌落培養，經多次平板劃線純化，獲得菌株OA-1。

1.2 菌株OA-1的生長及鑒定

1.2.1 菌落形態觀察、生長曲線 將菌株OA-1 劃線接種于2216E固體培養基，于30 ℃恒溫培養箱培養1～2 d，觀察菌落形態。該菌株接種于2216E 液體培養基，于30 ℃搖床培養，每3 h 取樣測定600 nm 處的光密度值D，直至進入衰亡期，繪制生長曲線。

1.2.2 菌株OA-1 的生化鑒定 根據杭州微生物試劑有限公司的細菌微量生化反應管說明書進行，包括革蘭染色、尿素、甘露糖、ONPG（β-半乳糖）、蔗糖、水楊酸、山梨醇、山梨糖、葡萄糖胺、半乳糖、葡萄糖、木糖、乳糖、丙二酸鹽、七葉苷、硝酸鹽還原、接觸酶、MR-VP試驗。

1.2.3 16S rDNA鑒定及系統發育分析 取對數生長期的菌液，離心，用細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技(北京)有限公司）提取基因組DNA，用細菌通用引物（27F 和1492R）擴增OA-1 的16S rDNA 基因。PCR 產物送至廣州生物工程股份有限公司測序，將測序結果在NCBI 上進行BLAST 同源性比對，選取相似度較高的基因序列，用MEGA10.0的鄰近法構建OA-1 系統發育樹，Bootstraps 重復檢驗1000次，將OA-1鑒定至種。

1.3 菌株OA-1與波吉卵囊藻藻菌體系的氮吸收特性分析

1.3.1 藻菌體系對微藻生長的影響 設置純藻對照組和藻菌聯合組，檢測各組葉綠素a 含量變化。培養體系為200 mL，對照組接入初始藻細胞密度為106mL-1的波吉卵囊藻，藻菌聯合組按藻菌比例1∶1（藻細胞密濃度為106mL-1，細菌濃度為106cfu·mL-1）接入波吉卵囊藻和所分離細菌[17]，連續培養10 d，每2 d 測定各組的葉綠素含量。采用體積分數95%乙醇萃取藻細胞中的色素，取5 mL藻液，以5 000 r/min離心10 min，棄上清，加入5 mL 體積分數95%乙醇重懸，于黑暗環境常溫萃取24 h，離心，以體積分數95%乙醇為參比，使用分光光度計測定萃取液上清在波長630、647 和664 nm 處的光密度（D），計算藻細胞葉綠素a含量[18]：

1.3.2 不同氮源條件下藻菌體系的氮吸收速率 配制鹽度為30的人工海水[19。以f/2培養基為基礎，配制無氮海水培養基。實驗前將波吉卵囊藻和OA-1用無氮培養基進行氮饑餓處理24 h。實驗設置藻菌體系、純藻體系和純菌體系，分別以硝酸鈉、亞硝酸鈉、氯化銨和尿素為氮源，參照f/2 培養基的氮濃度設置（氮元素起始濃度為0.88 mmol/L），共12 個處理組，每組設置3 個重復。將饑餓處理后的微藻和細菌按106mL-1或cfu/mL 分別接入純藻體系組和純菌體系組，藻菌體系按照藻菌1∶1構建，培養水體為100 mL 的f/2 海水培養基，置于光照培養箱中恒溫恒光（25 ℃，2 000 lx）培養4 h[20]。培養結束后將培養液過0.22 μm 濾膜，用Multi N/C 2100 測定濾液中的氮濃度。氮吸收速率計算公式[21]：

式中，P為氮吸收速率（μmol·h-1·g-1），c0、ct分別為實驗前后水體中氮營養鹽濃度（μmol/L），V為水體體積（L），m為生物的干質量（g），t為時間（h）。

1.3.3 不同氮濃度條件下藻菌體系的氮吸收速率在f/2 無氮海水培養基（同1.3.2）中分別以硝酸鈉、亞硝酸鈉、氯化銨和尿素為氮源，配制初始氮濃度為1、3、5、7 mmol/L 的四種培養基。氮饑餓處理同1.4.2，將饑餓處理后的微藻和細菌按106mL-1或cfu/mL 接入100 mL 上述不同氮濃度的培養基中，構建1∶1 藻菌體系，置于光照培養箱中恒溫恒光（25 ℃，2 000 lx）培養4 h，每組設置3 個重復。氮吸收速率測定及計算同1.3.2。

2 結果

2.1 菌株OA-1的形態和生長特征

菌株OA-1 橘紅色，圓形，隆起，邊緣整齊，略透明，表面光滑，濕潤；隨著培養時間的延長，菌落顏色逐漸加深（圖1）。OA-1 的生長曲線見圖2，在0～3 h處于延滯期，3～18 h處于指數生長期，18 h后達到穩定期，33 h時進入衰亡期。

圖1 OA-1菌株的菌落形態Fig.1 Colony morphology of OA-1 strain

圖2 菌株OA-1的生長曲線Fig.2 Growth curve of strain OA-I

2.2 菌株0A-1的生理生化特性

OA-1的生理生化鑒定結果如表1所示。該菌革蘭染色呈陰性，尿素、ONPG、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖胺、硝酸鹽還原和MR-VP反應陽性，甘露糖、半乳糖、木糖、乳糖、丙二酸鹽、水楊酸、山梨醇、山梨糖、七葉苷和接觸酶反應陰性。可見，該細菌可利用有機氮源尿素,對硝酸鹽有還原作用，可應用于構建藻菌體系，處理水體中的氮。

表1 OA-1菌株生理生化鑒定Table 1 Physiological and biochemical identification results of OA-1 strain

2.3 16S rDNA鑒定及系統發育分析

PCR擴增獲得片段大小為1 410 bp的16S rDNA序列，NCBI GeneBank 數據庫序列號OM276863，序列為

經Blast 比對，所構建系統發育樹見圖3。圖3顯示，該菌株與多株居海噬冷菌（Algoriphagusmarincola）聚為一支，同源性達99%，結合形態特征及生化鑒定，將該菌株確定為居海噬冷菌。

圖3 基于16S rDNA基因序列同源性的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence homology

2.4 藻菌體系對微藻生長的影響

居海噬冷菌與波吉卵囊藻共培養10 d 后，葉綠素a含量均高于純藻培養對照組（圖4），藻菌體系組的葉綠素a 質量濃度最高達2.74 mg/L，對照組僅為1.88 mg/L，增加45.74%，表明居海噬冷菌促進了波吉卵囊藻葉綠素a 的積累，在該藻菌體系的條件培養下，微藻生長更快，該菌株可用于構建與波吉卵囊藻的藻菌體系。

圖4 藻菌體系對波吉卵囊藻葉綠素a含量的影響Fig.4 Effects of algae-bacteria system on chlorophyll a content of Oocystis borgei

2.5 不同氮源條件下藻菌體系的氮吸收速率

在4種氮源條件下，藻菌體系、純藻體系和純菌體系之間氮吸收速率差異均顯著（P<0.05）（圖5），藻菌體系組均顯著高于單獨培養的微藻或細菌。以亞硝酸鈉和氯化銨為氮源時，藻菌體系組氮吸收速率高于純藻和純菌體系之和，說明在對這兩種氮源的利用過程中，居海噬冷菌和波吉卵囊藻存在協同作用。

圖5 不同培養體系對氮的吸收速率Fig.5 Nitrogen absorption rates in different culture systems

2.6 不同氮源及氮濃度條件下藻菌體系的氮吸收速率

圖6表明，在4 種不同的氮源中，藻菌體系氮濃度水平對氮吸收速率顯著影響（P<0.05）。在以硝酸鈉為氮源的培養基中，在7 mmol·L-1的最高氮濃度時，藻菌體系吸收速率達36.93 μmol·h-1·g-1。在以亞硝酸鈉為氮源的培養基中，在3 mmol·L-1氮濃度時的吸收速率最高，為6.28 μmol·h-1·g-1。在以氯化銨為氮源的培養基中，在氮濃度3 mmol·L-1時有吸收速率平均值最高，為20.09 μmol·h-1·g-1，與5 mmol·L-1氮濃度時差異不顯著，但氮濃度達7 mmol·L-1時，吸收速率顯著下降（P<0.05）。在以尿素為氮源的培養基中，隨著氮濃度的升高吸收速率先升后降，在5 mmol·L-1氮濃度時最高，為63.58 μmol·h-1·g-1，隨后下降。可知，相較于其他三種氮源，該藻菌體系在以亞硝酸鈉為氮源時，對氮的吸收速率明顯偏低，說明此藻菌體系對亞硝態氮的吸收效果不明顯；該藻菌體系對硝酸鈉的耐受性較高，以硝酸鈉為氮源時，隨著氮濃度的升高，吸收速率也升高。

圖6 藻菌體系在不同氮源及氮濃度中的氮吸收速率Fig.6 Nitrogen absorption rate of algae-bacteria system in different nitrogen sources and concentrations

3 討論

3.1 藻菌體系構建及其功能

微藻為水生環境中最重要的初級生產者，對水體的穩定有不可替代的地位。微藻細胞向環境中釋放營養物質，吸引眾多細菌在其周圍生活，形成以藻細胞為核心的富營養區域——藻際環境。不同的微藻向環境釋放的物質不同，形成的藻際環境存在差異。細菌的數量和種類對微藻的影響較大。假單胞菌（Pseudomonassp.）BB1-a 可促進普通小球藻的生長[22]；固氮螺菌（Azospirillum brasilense）會接受小球藻釋放的信號物質誘導分泌吲哚乙酸（IAA），促進小球藻的生長[23]；從黃化的螺旋藻（Spirulinasp.）體內分離的一株鹽單胞菌（Halomonassp.）則會明顯抑制螺旋藻的生長[24]。在養殖環境中存在多種細菌，一些細菌的硝化和反硝化作用等可有效利用水體中的無機氮，而有害細菌則會危害養殖動物，造成經濟損失。因此，建立和維持穩定的藻菌群落結構是生態健康養殖的基礎，合理利用水體中微藻和細菌的互利、共生關系，增加水中元素利用率可減少養殖過程中的污染，是提高養殖成活率和經濟效益的有效途徑。

同一種微藻會隨所處環境的改變而影響藻際微生物的群落結構[25]，不同微藻和細菌對不同水質環境的適應性有較大差別，其生長和對水體營養物質的吸收能力亦有不同[26]，因此，在養殖環境中構建藻菌體系時，宜優先選用本土分離的微藻和細菌種類。試驗用波吉卵囊藻分離自對蝦養殖池塘[27]，在實驗室穩定環境中長時間培養，其藻際微生群落結構相對固定，分離的居海噬冷菌長期附生于波吉卵囊藻。通過分離藻際菌群中的促生菌，可構建有價值的藻菌體系，探究藻菌相互作用機制等。段露露等[28]發現，在分離自杜氏鹽藻（Dunaliella salina）的鹽單胞菌與杜氏鹽藻的藻菌體系中，杜氏鹽藻葉綠素a 含量相比對照組提高36.3%，β-胡蘿卜素增加56.4%。王書亞等[29]將微小桿菌（Exiguobacterium collins）、假單胞菌（Pseudomonadaceaesp.）和枯草芽孢桿菌分別與小球藻構建藻菌體系，發現葉綠素a 含量比純培養的小球藻提高了1.79 倍、1.49 倍和1.58 倍。在本研究構建的藻菌體系中，波吉卵囊藻的葉綠素a 含量達到2.74 mg/L，比對照組增加45.74%。微藻和細菌之間存在復雜的相互作用關系，藻菌的種類、所處環境、自身生長狀況等因素均影響微藻和細菌的相互作用效果，所以藻菌間相互作用并非一致，可能存在著互利共生、偏利共生、競爭或拮抗的關系，營養環境與營養交換對二者間相互作用似起重要作用[30-31]。本研究中，在不同溶解態氮環境中，藻菌體系的氮吸收速率均高于純藻或純菌體系，本研究表明，居海噬冷菌可利用有機氮源尿素，對硝酸鹽有還原作用，所以在以尿素或硝酸鈉為氮源時，藻與菌對這兩種氮的利用均較高，藻菌體系協同效果不如在以亞硝酸鈉或氯化銨為氮源時明顯。綜上，居海噬冷菌OA-1 可顯著促進波吉卵囊藻的生長，且二者的藻菌體系對氮的吸收速率顯著高于單獨培養體系，其作用機制、具體功能及應用需進一步探索。

3.2 藻菌體系對氮的吸收規律

氮影響生物體細胞的分裂和生長，是生物生長的必需元素之一。微藻和細菌通過主動運輸吸收水體中的溶解態氮，在氮吸收上存在“飽和效應”[32]。假微型海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）在尿素處理組的生長較好，但高濃度的銨鹽會對其產生抑制[33]。孟鴿等[34]研究發現，銨鹽會對藻產生抑制。本研究也有高濃度的銨態氮、尿素氮和亞硝銨態氮對藻菌體系的氮吸收速率產生抑制的結果。以硝酸鈉為氮源時，隨氮濃度的升高，吸收速率隨之增高，但在其他三種氮源中均出現拐點，亞硝酸鈉為氮源時拐點在氮濃度3 mmol·L-1，氯化銨和尿素為氮源時，拐點出現在氮濃度5 mmol·L-1。因此亞硝酸鹽氮對氮的吸收抑制早于其他2種氮源。

水體微生物對不同形式的溶解態氮有選擇性利用的特征，所以不同的氮源會對藻菌體系的氮吸收能力產生影響。在本研究所設氮濃度梯度下，藻菌體系對4 種氮源的氮吸收速率均有顯著差異。4種氮源間，對尿素氮的吸收速率普遍較高，其次是銨態氮，亞硝態氮的吸收速率較低。劉燕[35]研究發現，小球藻與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）的藻菌體系對銨態氮的利用效果最好，高于硝態氮。本研究中，銨態氮的吸收速率較高，其原因是細菌通過硝化過程直接利用銨態氮，藻菌體系中藻和菌的協同作用提高了對銨鹽的利用效果[36-37]。微藻不僅可利用水體中溶解性無機氮，亦可利用尿素等有機氮[38]，異養菌的引入提高了對有機氮的利用效率，可能是本研究中藻菌體系對尿素氮吸收速率較高的原因。

藻和菌之間通過交換代謝產物形成互利共生關系，增強了對養殖水體營養物質的吸收效率[39]。隨著集約化、高密度養殖的推廣，養殖水體中的氮磷等元素更易堆積，將藻菌體系運用于水產養殖水調控，符合生態學原理，生態環保，有能耗小、成本低、效率高等優點[40]。但現實環境的養殖水環境中變量因素較多，不同微藻和細菌的組合及藻菌比例的差異都表現出特異性，對藻菌體系還應深入研究。

4 結論

1）從室內培養的波吉卵囊藻藻際微生物群落中分離出1株促生菌，經形態觀察、生理生化鑒定和16S rDNA序列比對，鑒定為居海噬冷菌（A.marincola）。

2）菌株OA-1 與波吉卵囊藻共培養可促進藻的生長，藻的葉綠素a含量比對照組增加45.74%。

3）波吉卵囊藻與居海噬冷菌的藻菌體系對氮的吸收速率顯著高于純藻體系和純菌體系，在以亞硝酸鈉和氯化銨為氮源時，藻菌間存在明顯的協同作用。

4）藻菌體系對氮的吸收速率存在“飽和效應”，以尿素或氯化銨為氮源時，在氮濃度5 mmol·L-1出現吸收拐點，以亞硝酸鈉為氮源時，在3 mmol·L-1出現吸收拐點，過高的氮濃度會抑制藻菌體系對氮的吸收。