鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠腸道菌群及抗氧化能力的影響

任吳疆，張靜，霍清，劉彥霞，郭豫，趙建，白海燕*

（1.北京聯合大學生物化學工程學院，北京 100023；2.北京聯合大學應用文理學院保健食品檢驗中心，北京 100191）

腸道菌群是指分布在腸道的微生物菌群，它們與腸道系統共同構成了腸道微生態，是維持腸道正常功能的基本保障[1]。人體胃腸道內棲息著數量及種類繁多的微生物，這些微生物通過生物拮抗、免疫反應和調節機體代謝等方式影響人體健康[2-3]。研究發現，腸道菌群不僅能夠調節腸道的動態平衡[4]，還能分解食物中的大分子多糖，參與營養物質的消化和吸收，維持腸上皮屏障的完整性[5]。腸道微生物菌群的結構、功能及其產生的生物活性代謝產物對維持人體腸道健康具有重要意義[6]。益生菌是一種能夠平衡宿主腸道內菌群，并且可以產生活性物質，同時對宿主產生有益作用的微生物，是人類及動物腸道內尤為重要的生理菌[7]。乳酸菌作為廣泛分布在動物腸道內的一種益生菌，具有多種益生功能，不僅能夠調節機體的免疫系統，維持腸道菌群平衡，還具有一定的抗氧化能力，能夠清除腸道內的活性氧分子，保持腸道微生物生態系統的穩定[8]。

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus，LGG）多存在于人和動物的腸道內，屬于乳桿菌屬，鼠李糖亞種，是厭氧、耐酸、不產芽孢的一種革蘭氏陽性益生菌，具有耐膽汁鹽、耐多種抗生素等生物學特點[9]，其對腸道內環境的耐受性好、腸道黏著率高、定植能力強，有助于提高機體非特異性免疫，增強機體抵抗腸道致病菌感染的能力[10]。鼠李糖乳桿菌R9639（Lactobacillus rhamnosus R9639）是從自然發酵酸馬奶中分離得到的1株益生菌，具有胃腸消化液良好的耐受性，能夠以活的狀態進入人體腸道。聶穎蘭等[11]的研究發現鼠李糖乳桿菌R9639可以通過增強體液免疫、細胞免疫、單核-巨噬細胞功能和免疫細胞中的自然殺傷細胞活性來增強小鼠的免疫功能。但目前研究中鼠李糖乳桿菌R9639在腸道菌群及抗氧化能力方面的相關研究較少，有待進一步探究。

因此，本研究主要采用鼠李糖乳桿菌R9639制劑灌胃正常小鼠，探究其對正常小鼠體重和攝食、小腸形態、臟器系數、小腸和肝臟組織抗氧化水平、腸道微生物和小鼠糞便短鏈脂肪酸的影響，以期為闡明鼠李糖乳桿菌R9639和宿主的相互作用關系積累基礎研究，并為益生菌制劑在保健食品領域應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物

44只健康SPF級BALB/c雄性小鼠[體重18 g～20 g，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2017-0038]：北京華阜康生物科技股份有限公司。所有動物均飼養于北京聯合大學應用文理學院SPF級動物房，飼養室溫度為（20±2）℃、相對濕度為45%～60%。本研究動物實驗設計和實施方案通過了北京聯合大學倫理委員會審核和批準（實驗動物倫理委員會意見書編號20210902）。

1.2 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌 R9639（2×1011CFU/g）：北京科拓恒通生物技術股份有限公司；谷胱甘肽（gutathione，GSH）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（gutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）測定試劑盒、丙二醛（mlondialdehyde，MDA）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；白細胞介素-2（iterleukin-2，IL-2）、白細胞介素-6（iterleukin-6，IL-6）、白細胞介素-1β（inter-leukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tmor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒：武漢華美生物工程有限公司；伊紅美藍瓊脂培養基、疊氮鈉-結晶紫-七葉苷瓊脂培養基、乳桿菌選擇性培養基、雙歧桿菌選擇性培養基、產氣莢膜梭菌選擇性培養基：麥克林試劑公司。

1.3 儀器與設備

Infinite M NANO TECAN酶標儀：廣州深華公司；CPA225D電子分析天平：美國Sartorius公司；Centrifuge 5702 RH-低速離心機：德國Eppendorf公司；Hula Dancerbasic漩渦振蕩器：德國IKA公司；Milli-QEQ7000超純水機：法國Millipore公司；UV-4802紫外可見分光光度計：尤尼柯儀器有限公司；GI54DW高壓滅菌鍋：美國Zealway公司；DHG-9003電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；NU-9483E超低溫冰箱：美國Nuaire公司；HHW21.420D恒溫水箱：天津泰斯特儀器有限公司；Agilent 8890氣相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及分組處理

取44只SPF級健康雄性BALB/c小鼠，適應性飼養7 d后，隨機分為4組，每組11只，分為對照組（C）、低劑量組（L）、中劑量組（M）、高劑量組（H），其中低、中、高劑量組分別灌胃 0.25×108、0.50×108、1.50×108CFU/kg鼠李糖乳桿菌R9639制劑，對照組灌胃相同體積的生理鹽水，連續灌胃30 d。實驗過程中小鼠自由攝取食物和飲水。灌胃期間每天測量小鼠體重和攝食情況并記錄。

1.4.2 小鼠臟器系數的測定

BALB/c小鼠灌胃結束后，將所有小鼠脫頸處死，進行解剖，取出心、肝、脾、肺、腎、胸腺等臟器進行稱重并記錄，計算其臟器系數。

1.4.3 小鼠小腸質量和長度的測定

BALB/c小鼠解剖后，取出并測量小腸的質量和長度，比較各組之間小鼠小腸質量和長度的變化。

1.4.4 小鼠血清中炎癥細胞因子的含量測定

BALB/c小鼠脫頸處死前，摘眼球取血，離心取小鼠血清，用酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定IL-2、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量，具體實驗步驟嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.4.5 小鼠抗氧化能力水平的測定

BALB/c小鼠解剖后，取出小腸的空腸段和肝臟組織，對組織中的MDA、T-SOD、GSH、GSH-Px含量進行測定，詳細步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.6 小鼠糞便菌群計數

在小鼠灌胃的第0天和第30天，無菌操作收集所有小鼠糞便0.1 g，加入稀釋液充分振蕩混勻，10倍梯度稀釋至10-8，分別用相應的培養基進行培養，培養結束后計算每克濕便中腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌和產氣莢膜梭菌的活菌數，均取對數計算以lg（CFU/g）表示。腸桿菌選擇伊紅美藍瓊脂培養基，（36±1）℃培養24 h；腸球菌選擇疊氮鈉-結晶紫-七葉苷瓊脂培養基，（36±1）℃培養48 h；乳桿菌選擇乳桿菌選擇性培養基，（36±1）℃培養48 h；雙歧桿菌選擇雙歧桿菌選擇性培養基，（36±1）℃厭氧培養48 h；產氣莢膜梭菌選擇產氣莢膜梭菌選擇性培養基，（36±1）℃厭氧培養24 h。

1.4.7 小鼠糞便的短鏈脂肪酸檢測分析

參考Zubaidah等[12]的方法，采用氣相色譜法檢測乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸的含量。每只小鼠取糞便約0.2 g，加入0.25 mL 25% H3PO3，在室溫25℃下振蕩混勻，靜置1 min，加入1.25 mL丙酮，充分混勻后3 000 r/min離心5 min，取上清液0.35 mL，再加入0.65 mL丙酮，12 000 r/min離心5 min，取上清液200 μL，使用氣相色譜儀進行檢測。

氣相色譜條件為色譜柱：DB-FFAP毛細管柱；載氣：純度為99.99%氮氣；柱溫：初始溫度40℃，以10℃/min升至200℃，保持3 min，檢測器溫度為270℃。

1.5 統計學分析方法

應用SPSS 26.0統計軟件進行顯著性分析，采用單因素方差分析，所有數據均以均值±標準差表示。小鼠糞便細菌計數實驗采用獨立樣本t檢驗，各組自身前后比較采用成對t檢驗。p＜0.05表示有顯著差異，p＜0.01表示有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠體重和攝食的影響

鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠體重和攝食的影響見圖1。

圖1 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠體重和攝食的影響Fig.1 The effect of Lactobacillus rhamnosus R9639 on body weight and food intake of mice

由圖1 A可知，小鼠體重隨著時間的緩慢延長，各組之間小鼠體重無顯著差異（p＞0.05）；由圖1 B可知，小鼠的攝食各組之間也無顯著差異（p＞0.05）。上述結果表明鼠李糖乳桿菌R9639制劑對健康小鼠體重、攝食均無影響。

2.2 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠臟器系數的影響

臟器系數又稱臟體比，是實驗動物某臟器的質量與其體重的比值。臟器系數可反映動物內臟的功能狀態，是機體營養代謝和健康狀態的綜合表征，也是藥物安全評價中必要的檢測指標。正常時各臟器質量與體重的比值比較恒定。一般情況下，臟器系數增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；臟器系數減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變[13]。鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠臟器系數的影響見表1。

表1 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠臟器系數的影響Table 1 The effect of Lactobacillus rhamnosus R9639 on the organ coefficient of mice

由表1可知，各劑量組與對照組心、肝、脾、肺、腎、胸腺等主要臟器相比均無顯著差異（p＞0.05），上述結果說明鼠李糖乳桿菌R9639制劑對小鼠臟器系數無顯著影響（p＞0.05）。

2.3 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠小腸質量和長度的影響

小腸作為消化營養物質最重要的器官，與機體的健康密切相關[14]，小腸長度過短、質量過輕可能會造成短腸綜合征，小腸長度和質量的增加不僅可以改善腸道的發育，還可以加快機體對營養物質的消化吸收[15-16]。此外，微生物群可以影響腸道形態，從而改善腸道發育、健康和功能[17]。鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠小腸質量和長度的影響見圖2。

圖2 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠小腸質量和長度的影響Fig.2 Effects of Lactobacillus rhamnosus R9639 on the quality and length of small intestine in mice

由圖2可知，鼠李糖乳桿菌R9639灌胃后的小腸質量和長度均無顯著差異（p＞0.05），表明其對小腸質量和長度無明顯影響。

2.4 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠血清中炎癥細胞因子含量的影響

研究表明，在氧化自由基過多的情況下，T細胞功能低下，不能有效控制B細胞，導致自身抗體過多產生，使機體不能準確識別自己和非己，從而導致一些嚴重的疾病。益生菌不僅能夠調節腸道微生物群，還能調節局部或全身水平的免疫。益生菌的抗炎作用是通過免疫調節和炎癥細胞因子調節來實現的[18]。Wong等[19]的研究發現益生菌、益生元有抗炎作用，可以通過調節腸道微生物群來加強腸道屏障、抑制IL-6/STAT3信號傳導。本研究對小鼠血清中炎癥因子含量的影響見圖3。

圖3 小鼠血清中炎癥細胞因子的含量Fig.3 The content of inflammatory cytokines in serum of mice

由圖3可知，本實驗灌胃鼠李糖乳桿菌R9639制劑后，低劑量組與對照組相比，IL-1β水平極顯著降低（p＜0.01），IL-6水平顯著降低（p＜0.05）；中劑量組與對照組相比，IL-6、IL-1β 水平極顯著降低（p＜0.01）；高劑量組與對照組相比，IL-2、IL-6、IL-1β水平極顯著降低（p＜0.01），TNF-α水平顯著降低（p＜0.05）。上述結果表明，在鼠李糖乳桿菌R9639制劑灌胃后，IL-2、IL-6、IL-1β、TNF-α細胞因子水平均有所降低，說明鼠李糖乳桿菌R9639制劑對炎癥細胞因子水平具有一定的調節作用，有助于維持腸道微生物群的生態平衡，從而避免了因腸道生態失衡可能引起的腸道屏障完整性被破壞而導致局部或全身炎癥。

2.5 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠組織抗氧化水平的影響

抗氧化是抗氧化自由基的簡稱，人體由于外界污染、放射線照射以及自身新陳代謝等活動會不斷產生氧化自由基。作為抗氧化系統中重要的酶，SOD和CAT的活性高低可以表示機體清除自由基能力的強弱，體內脂質過氧化的程度可以用MDA水平反映[20]。以往研究結果顯示，攝入乳酸菌有助于提高抗氧化能力，且不同菌株之間的抗氧化能力不盡相同[21]。Qian等[22]的研究發現植物乳桿菌CQPC11可以提高衰老小鼠血清、肝臟和脾臟組織中SOD、GSH-Px和GSH的水平，降低MDA的水平。Zhang等[23]的研究發現發酵乳桿菌JX306能顯著降低血清、腎臟和肝臟組織中MDA的水平，提高GSH-Px的水平和總抗氧能力。本研究對小鼠組織抗氧化水平的影響見表2。

表2 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠組織抗氧化水平的影響Table 2 The effect of Lactobacillus rhamnosus R9639 on antioxidant level in mice tissues

由表2可知，小腸組織中，低劑量組與對照組相比，MDA的水平顯著降低（p＜0.05）；中劑量組與對照組相比，T-SOD和GSH的水平顯著升高（p＜0.05），GSH-Px的水平極顯著升高（p＜0.01），MDA的水平極顯著降低（p＜0.01）；高劑量組與對照組相比，T-SOD、GSH和GSH-Px水平均極顯著升高（p＜0.01），MDA水平極顯著降低（p＜0.01）。肝臟組織中，低劑量組與對照組相比，GSH和GSH-Px水平顯著升高（p＜0.05）；中劑量組與對照組相比，T-SOD、GSH和GSH-Px水平均極顯著升高（p＜0.01）；高劑量組與對照組相比，T-SOD、GSH和GSH-Px水平均極顯著升高（p＜0.01），MDA水平顯著降低（p＜0.05）。結果表明，各劑量組指標與正常小鼠相比，對T-SOD、GSH和GSH-Px水平均有不同程度提高，并降低了MDA的水平，表現出了劑量依賴性，說明鼠李糖乳桿菌R9639制劑有助于改善、提高小鼠小腸和肝臟組織的抗氧化水平，增強小鼠小腸和肝臟組織的抗氧化防御系統能力，從而維持了小鼠腸道內微生物的生態平衡。

2.6 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠腸道常見微生物的影響

對灌胃鼠李糖乳桿菌R9639制劑前后的小鼠糞便中腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌和產氣莢膜梭菌進行計數，結果見圖4。

圖4 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠腸道微生物的影響Fig.4 Effects of Lactobacillus rhamnosus R9639 on the intestinal microbes of mice

由圖4可知，灌胃前第0天，腸桿菌、腸球菌、產氣莢膜梭菌、乳桿菌和雙歧桿菌各組數量與第30天對照組或第0天自身比較均無顯著差異（p＞0.05），灌胃后第30天，低劑量組各菌含量與第30天對照組或第0天自身比較均無顯著差異（p＞0.05），中劑量組和高劑量組乳桿菌和雙歧桿菌含量均有所增加，其中中劑量組乳桿菌和雙歧桿菌與第30天對照組相比均有顯著差異（p＜0.05），與第0天自身相比，分別有顯著差異（p＜0.05）和極顯著差異（p＜0.01）。高劑量組乳桿菌和雙歧桿菌與第30天對照組及第0天自身相比均有極顯著差異（p＜0.01）。結果表明，灌胃中、高劑量鼠李糖乳桿菌R9639制劑乳桿菌和雙歧桿菌數量顯著增加，有助于調節和改善小鼠腸道菌群，促進小鼠腸道的健康。

2.7 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠糞便中短鏈脂肪酸的影響

短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）也稱揮發性脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、異丁酸，SCFAs對于維持大腸的正常功能和結腸上皮細胞的形態和功能具有重要作用，也可促進鈉的吸收，丁酸在這方面的作用比乙酸和丙酸更強，并且丁酸可以增加乳酸桿菌的數量和減少大腸桿菌的數量。目前研究表明，SCFAs主要由腸道內未消化的碳水化合物經厭氧菌酵解產生，結腸厭氧菌發酵產生乙酸、擬桿菌門發酵產生丙酸、厚壁菌門發酵代謝產生丁酸[24]，這些菌屬及其產生的SCFAs對腸屏障功能的維護有重要作用[25]。鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠糞便中短鏈脂肪酸的影響見圖5。

圖5 鼠李糖乳桿菌R9639對小鼠糞便短鏈脂肪酸的影響Fig.5 Effects of Lactobacillus rhamnosus R9639 on SCFAs in feces of mice

由圖5可知，各劑量組與對照組相比，中、高劑量組乙酸、丙酸、丁酸含量均極顯著升高（p＜0.01），低劑量組丙酸和丁酸含量與對照組相比極顯著升高（p＜0.01）、乙酸含量與對照組相比顯著升高（p＜0.05），異戊酸和異丁酸各劑量組之間無顯著差異（p＞0.05）。結果表明，在鼠李糖乳桿菌R9639制劑灌胃后，糞便SCFAs的檢測多為乙酸、丙酸和丁酸，這些SCFAs都能在短時間內被結腸吸收，鼠李糖乳桿菌R9639制劑的干預對腸道中SCFAs含量的影響存在一定的量效關系。

3 結論

本研究主要探究了鼠李糖乳桿菌R9639制劑對健康小鼠小腸和肝臟組織抗氧化水平、血清中炎癥細胞因子含量、腸道微生物和糞便中短鏈脂肪酸的影響。結果表明鼠李糖乳桿菌R9639可以有效降低血清中IL-2、IL-6、IL-1β、TNF-α炎癥細胞因子水平，提高小腸和肝臟組織中T-SOD、GSH和GSH-Px的水平、降低MDA的水平，提高組織的抗氧化水平和機體的免疫水平、增加腸道內的有益菌、減少有害菌，提高了腸道中短鏈脂肪酸乙酸、丙酸和丁酸的含量。鼠李糖乳桿菌R9639制劑可以通過調節機體內抗氧化酶的活性、炎癥細胞因子的水平來維持腸道內微生物的生態平衡，對促進小鼠的健康有一定效果。