兩種螺旋藻劑型的體外模擬消化研究

秦欣，譚應宏，徐青山，陳再德，駱其君，*

（1.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；2.云南省微藻重點實驗室，云南 麗江 674100）

鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）含有多種營養(yǎng)物質，是目前所知營養(yǎng)成分最全面、最均衡的天然食品之一，是一種高蛋白、低脂肪的高營養(yǎng)功能性食品，蛋白質含量高達60%～70%[1]。此外，還有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、降血壓[4]等生物活性。因此，螺旋藻被聯(lián)合國糧農組織評價為“21世紀人類最佳營養(yǎng)品”[5]。養(yǎng)殖螺旋藻采收后，經噴霧干燥加工為初級產品——干粉，干粉進一步加工為商品——螺旋藻片劑，螺旋藻片劑是目前重要的產品形式。

體外模擬消化是一種以合適的消化條件來仿生人體消化道運行的反應[6]，具有成本較低、可控性高、周期短、易操作的特征。近年來，在食品安全、食品營養(yǎng)以及食品加工等領域得到廣泛的應用[7]。林路秀等[8]應用體外消化模型分析了海藻（紫菜和海帶）水煎液中的無機金屬形態(tài)和生物可給性。陳再德等[9]通過構建體外模擬消化模型探究了不同溫度烘烤的壇紫菜的消化效果。

目前涉及螺旋藻的研究焦點在于養(yǎng)殖技術及加工。螺旋藻產品在人體整個消化過程中的營養(yǎng)物質和功能活性的變化少有報道。楊衛(wèi)杰等[10]通過模擬體外胃腸消化對比了螺旋藻營養(yǎng)制劑蛋白消化速率和消化程度。若通過人體試驗或者相關的動物實驗來探究螺旋藻的整個消化和吸收過程較為困難，而應用體外模擬消化的解決了這一難題。本文以螺旋藻粉劑和片劑為原料，構建體外模擬消化模型，比較水解、酸解、高溫和高壓蒸汽等方式的處理對消化的影響，從而為螺旋藻產品的消化利用及加工產品的形式提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

螺旋藻粉劑（BE201906-3，簡稱粉劑）、螺旋藻片劑（規(guī)格每片0.5 g，執(zhí)行標準Q/LBE003S，簡稱片劑）：麗江程海保爾生物開發(fā)有限公司；唾液淀粉酶（300 U～1 500 U）、胃蛋白酶（≥250 U）、胰酶（4×USP）、膽汁鹽：美國 Sigma公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、領苯二甲醛、β-巰基乙醇（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；三氯乙酸（分析純）、十二烷基硫酸鈉（分析純）、考馬斯亮藍-G250、苯酚（分析純）、甲醇（分析純）、鹽酸（分析純）、硼酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

1-16K低溫高速冷凍離心機、Varioskan Flash酶標儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；DHG-9123A烘箱：寧波江南儀器廠；MQT-60R搖床：上海旻泉儀器有限公司；瑞士Salvis WB20恒溫水浴鍋：成都華衡儀器有限公司；T3L-385B烤箱：美的集團股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理

水解、酸解、高溫及高壓蒸汽處理粉劑和片劑，設置不經過以上方式處理為對照組（CK）。分別取0.5 g粉劑和0.5 g片劑以料液比1∶20（g/mL）：于100℃蒸餾水煮沸處理（水解組，WJ）；于100℃的0.01 mol/L HCl下酸解處理20 min（酸解組，SJ）；于120℃高溫處理20 min（高溫組，GW）；于103.4 kPa、121.3℃高壓蒸汽處理20 min（高壓蒸汽組，ZQ）。所有試驗均設置3組平行，并避光操作。

1.3.2 體外模擬消化

配制1.29 μg/mL的唾液（pH6.80±0.05）、3.97 μg/mL胃液（pH1.20±0.05）、15 μg/mL 腸液以及 40 μg/mL 膽汁鹽溶液[9，11-12]。

體外口腔消化：分別稱取0.5 g經水解、酸解、高溫及高壓蒸汽處理后的粉劑和片劑，置于50 mL的錐形瓶中，加入12.5mL唾液（37℃預熱10 min），調節(jié)pH值至 6.80±0.05，充分混合后于恒溫搖床（37℃、150 r/min）消化5 min，完成后，立即置于70℃水浴5 min終止反應，樣品于4℃、10 000 r/min離心10 min，上清液于-80℃下保存待測。

體外口胃連續(xù)消化：經唾液消化后的消化液用1 mol/L HCl調節(jié)其pH值至1.20±0.05，并將其轉入錐形瓶中，加入15 mL胃液（37℃預熱10 min），充分混合后于恒溫搖床（37℃、150 r/min）消化4 h，消化完成后，樣品處理同上。

體外口胃腸連續(xù)消化：經胃液消化后的消化液用1 mol/L NaOH調節(jié)其pH值至7.00±0.05，并將其轉入錐形瓶中，加入37.5 mL腸液和10 mL膽汁鹽，充分混合后于恒溫搖床（37℃、150 r/min）消化5 h，完成后，樣品處理同上。

1.3.3 營養(yǎng)指標物質含量測定

游離氨基酸含量參考文獻[13]的方法測定；可溶性蛋白含量參考文獻[14]的方法測定；可溶性糖含量參考文獻[15]的方法測定；還原糖含量參考文獻[16]的方法測定。

譯者交互隱形與譯本呈現(xiàn) ………………………………………………………………… 任東升 王 芳（6.69）

1.3.4 抗氧化活性的測定

DPPH自由基清除率的測定參考文獻[17]的方法，稍作修改。配制0.2mmol/L DPPH乙醇溶液，取100 μL待測樣品加入到100 μL的DPPH乙醇溶液中，室溫（25℃）下避光反應30 min，于517 nm波長處測定吸光度。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2010處理數據，并使用SPSS 22.0進行數據分析，Origin 2019進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同方式處理對螺旋藻游離氨基酸含量的影響

不同方式處理對螺旋藻游離氨基酸含量的影響見圖1。

圖1 體外模擬消化過程中的螺旋藻游離氨基酸含量Fig.1 Free amino acid content of Spirulina platensis in simulated digestion in vitro

由圖1A可知，粉劑在消化前和口腔消化階段的SJ組中檢測不到游離氨基酸含量，可能是因為酸解處理對螺旋藻粉劑原有的游離氨基酸破壞較大，使之變成另外的形式存在，未到達檢測限。粉劑在消化前，ZQ組釋放游離氨基酸含量最高（10.30 mg/g），GW、WJ組含量次之，但均高于CK組。在口腔消化階段，各處理組游離氨基酸含量較消化前增加，其中，CK組達到13.32 mg/g，GW組為CK組的1.37倍，為各處理組中最高。在口胃消化階段，各處理組游離氨基酸含量較口腔消化階段增加，游離氨基酸含量在54.79 mg/g～124.00mg/g，ZQ組在各處理組中含量最高（124.55mg/g），為CK組的1.20倍，GW組和WJ組含量次之，SJ組含量最低。在口胃腸消化階段，游離氨基酸含量較口胃消化階段增加，且各處理組含量差異顯著（P＜0.05），游離氨基酸含量在222.92 mg/g～501.65 mg/g。ZQ、GW組游離氨基酸含量分別達到501.65、454.22 mg/g，為CK組的2.00、1.80倍，SJ組含量最低。綜上可知，粉劑在消化過程中游離氨基酸釋放效果為ZQ＞GW＞WJ＞CK＞SJ，且游離氨基酸釋放主要在胃腸道中。

由圖1B可知，片劑的CK組在口胃連續(xù)消化階段才檢測到游離氨基酸含量，這是因為在其他消化階段的游離氨基酸含量極低，未到達檢測限。片劑在消化前，各處理組的游離氨基酸含量差異顯著（P＜0.05），其中，ZQ組游離氨基酸含量為各處理組中最高，SJ組和GW組含量次之。在口腔消化階段，游離氨基酸含量有所增加，其中SJ組游離氨基酸含量達到最高，ZQ組含量次之。說明口腔消化對片劑的效果較低，可能是由于片劑處于一個未崩解的狀態(tài)，以及口腔消化環(huán)境溫和、消化時間較短的原因。在口胃連續(xù)消化階段，游離氨基酸含量較口腔消化后驟增，其中SJ組游離氨基酸含量最高，WJ含量次之，而GW組和ZQ組含量較低。在口胃腸連續(xù)消化階段，游離氨基酸含量較口胃消化后驟增，各處理組之間顯著差異（P＜0.05），且都高于CK組含量。WJ組含量最高（302.27 mg/g），為CK組的6.72倍，說明不同方式處理能促進片劑的消化，使其釋放大量的游離氨基酸。綜上，片劑消化效果為WJ＞SJ＞GW＞ZQ＞CK。

2.2 不同方式處理對螺旋藻可溶性蛋白含量的影響

不同方式處理對螺旋藻可溶性蛋白含量的影響見圖2。

由圖2A可知，粉劑在消化前，GW組可溶性蛋白含量與CK組含量接近，WJ組次之，而SJ組和ZQ組含量較低，遠遠低于CK組。說明SJ組和ZQ組處理方式對螺旋藻蛋白有抑制分解作用。在口腔消化階段后，各處理組可溶性蛋白含量變化不大，趨勢與消化前一致。在口胃消化階段，與口腔消化階段相比，可溶性蛋白含量整體均呈上升趨勢。各處理組無顯著差異（P＞0.05），說明胃消化環(huán)境能夠促進可溶性蛋白的釋放，可能是由于胃酸性環(huán)境對螺旋藻細胞壁具有破壞作用，導致螺旋藻蛋白的析出。在口胃腸消化階段，GW組可溶性蛋白含量達到最高（19.56 mg/g），WJ組僅次于GW組，均高于CK組。綜上可知，粉劑在消化過程中可溶性蛋白量釋放效果為GW＞WJ＞SJ＞ZQ＞CK。

圖2 體外模擬消化過程中的螺旋藻可溶性蛋白含量Fig.2 Soluble protein content of Spirulina platensis in simulated digestion in vitro

由圖2B可知，片劑在口胃腸消化階段檢測不到CK組、SJ組和ZQ組的可溶性蛋白含量，這是因為以上處理組的可溶性蛋白降低至低于檢測限。片劑在消化前，各處理組的片劑可溶性蛋白含量顯著差異（P＜0.05）。CK組為各處理組含量最高，而ZQ組和SJ組含量較低。說明經不同方式處理后對片劑蛋白具有破壞作用，高壓和酸解處理對螺旋藻蛋白影響最大。在口腔消化階段，片劑可溶性蛋白含量總體較消化前下降，變化趨勢與消化前類似。在口胃消化階段，片劑可溶性蛋白含量較口腔消化后有所增加。其中WJ組和SJ組無顯著性差異（P＞0.05），分別為CK組的1.90倍和1.82倍，ZQ組含量最低。在口胃腸消化階段，WJ組含量達到14.56 mg/g，為CK組的3.10倍。SJ組和GW組含量均高于CK組，而ZQ組含量最小，說明水解處理片劑有利于螺旋藻的消化。綜上，片劑可溶性蛋白釋放效果在WJ處理時最好。

2.3 不同方式處理對螺旋藻可溶性糖含量的影響

不同方式處理對螺旋藻可溶性糖含量的影響見圖3。

由圖3A可知，粉劑在消化前，WJ組和CK組可溶性多糖含量無顯著差異（P＞0.05），SJ組和ZQ組含量較低，分別為CK組的29.92%和23.51%，說明酸水解和高壓蒸汽處理抑制可溶性多糖含量釋放。在口腔消化階段，各處理組可溶性多糖含量增加。GW組含量與CK組無顯著差異（P＞0.05），ZQ組含量增加較少，僅為CK組的30.99%。在口胃連續(xù)消化階段，各處理組可溶性糖含量增加幅度較小，其中GW組含量達到各處理組中最高，為CK組的1.27倍，ZQ組含量最低，為CK組的62.94%。說明胃部消化對促進粉劑可溶性糖的釋放作用不大。在口胃腸連續(xù)消化階段，各處理組可溶性糖含量驟增。WJ組和SJ組含量遠遠高于CK組，GW組含量次之，ZQ組含量最低。綜上可知，粉劑在消化過程中可溶性糖釋放效果為SJ＞WJ＞GW＞CK＞ZQ。

圖3 體外模擬消化過程中的螺旋藻可溶性糖含量Fig.3 Soluble sugar content of Spirulina platensis in simulated digestion in vitro

由圖3B可知，片劑在消化前，GW組可溶性多糖含量最高，其他處理組含量較低，說明高溫處理可大大促進片劑可溶性糖的釋放。在口腔消化階段，各處理組片劑可溶性糖含量均增加，WJ組和SJ組分別為CK組的2.31倍和2.23倍，GW組與CK組無顯著差異（P＞0.05），ZQ組含量次之。在口胃消化階段，各處理組可溶性糖含量較口腔消化均增加，其中SJ組含量變化最明顯，為CK組的4.75倍，WJ組含量次之，ZQ組含量最低。在口胃腸消化階段，可溶性糖含量驟增，WJ組含量達到最高（198.72 mg/g），SJ組次之。綜上，片劑消化后可溶性糖釋放效果為WJ＞SJ＞ZQ＞CK＞GW。

2.4 不同方式處理對螺旋藻還原糖含量的影響

不同方式處理對螺旋藻還原糖含量的影響見圖4。

圖4 體外模擬消化過程中的螺旋藻還原糖含量Fig.4 Reducing sugar content of Spirulina platensis in simulated digestion in vitro

由圖4A可知，粉劑在消化前，各處理組還原糖含量顯著差異（P＜0.05），CK組含量最高，其他處理組含量較低，其中ZQ組含量最低。說明經不同方式處理后，粉劑的還原糖含量受到不同程度的影響。在口腔消化階段，各處理組還原糖含量均增加，SJ組和CK組無顯著差異（P＞0.05），WJ組和GW組含量均低于CK組，ZQ組含量最低（5.12 mg/g）。在口胃消化階段，還原糖含量較口腔消化后均增加，其中ZQ組含量為各處理組中最高，為CK組的1.56倍，SJ組含量次之。在口胃腸消化階段，粉劑的還原糖含量較口胃消化后增加，此時，SJ組含量最高，GW、WJ組含量次之，ZQ組含量與CK組無顯著差異（P＞0.05）。綜上可知，粉劑消化過程中還原糖釋放效果為SJ＞GW＞WJ＞CK＞ZQ。

由圖4B可知，片劑在消化前，各處理組還原糖含量較低，并顯著差異（P＜0.05），WJ組為CK組的2.22倍，為各處理組中含量最高。在口腔消化階段，還原糖含量較消化前均增加，WJ組增加幅度最大，為CK組的4.01倍，SJ組含量次之，為CK組的3.78倍，ZQ組含量變化不大。在口胃消化階段，各處理組還原糖含量均增加，CK組、GW組增長幅度較大，僅次于WJ組，但ZQ組含量增加不明顯，為各處理組中最低。在口胃腸消化階段，還原糖含量較口胃消化后均增加，GW組、WJ組均高于CK組，ZQ組仍為各組中最低，說明高溫和水解對片劑消化釋放還原糖有促進作用，而高壓蒸汽處理并不利于片劑的消化。綜上片劑消化過程中還原糖釋放效果為GW＞WJ＞CK＞SJ＞ZQ。

2.5 不同方式處理對螺旋藻DPPH自由基清除率的影響

在抗氧化機制中，DPPH自由基清除率是一個重要的指標。不同方式處理對螺旋藻DPPH自由基清除率的影響見圖5。

圖5 體外模擬消化過程中的螺旋藻DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH-scavenging rate of Spirulina platensis in simulated digestion in vitro

由圖5A可知，粉劑在消化前，各處理組的DPPH自由基清除率差異明顯，CK組的DPPH自由基清除率達到51.60%，SJ組和GW組無顯著性差異（P＞0.05），但均低于CK組，ZQ組DPPH自由基清除率最低。在口腔消化階段，整個處理組對DPPH自由基清除效果變化不大，CK組DPPH自由基清除率為各處理組中最大。在口胃消化階段，各處理組的DPPH自由基清除率均升高，CK組DPPH自由基清除率達到62.35%，此時，SJ組僅次于CK組，達到58.00%，其他各處理組之間無顯著差異（P＞0.05）。在口胃腸消化階段，較口胃消化后的DPPH自由基清除率均上升，此時DPPH自由基清除率在63.19%～71.59%，SJ組的清除率最高。

由圖5B可知，片劑在消化前，各處理組間差異不明顯（P＞0.05），DPPH自由基清除率在8.65%～14.42%之間。在口腔消化階段，DPPH自由基清除率較消化前增加，此時SJ組的抗氧化效果達到最大（23.79%），高于CK處理組，WJ組與CK組無顯著差異（P＞0.05），而ZQ組DPPH自由基清除率卻只有9.21%。在口胃消化階段，DPPH自由基清除率較口腔消化階段驟增，此時WJ組由17.54%增長到了50.20%，SJ組清除DPPH自由基效果次之，遠高于CK組。在口胃腸消化階段，各處理組的DPPH自由基清除率繼續(xù)上升，各處理組的變化趨勢與口胃消化后一致，WJ組相較于口胃消化階段的增幅為42.27%，遠遠高于CK組（66.11%），為各處理組中最高。因此，研究結果表明，水解處理后的片劑更易于消化。

3 討論與結論

3.1 不同處理方式對螺旋藻營養(yǎng)物質含量的影響

消化前，不同試驗條件處理的粉劑和片劑的蛋白質含量都比對照組低，而游離氨基酸含量卻較對照組高，尤其是SJ組和ZQ組的蛋白質含量更低，因為酸解和高壓蒸汽處理破壞了蛋白質的空間立體結構，使其發(fā)生了變性[18]。在口胃連續(xù)消化階段，ZQ組和GW組的粉劑游離氨基酸含量較高，而SJ組和WJ組的片劑游離氨基酸較高。這可能是在胃酸環(huán)境和胃蛋白酶作用下，經以上方式處理的粉劑和片劑可溶性蛋白暴露出胃蛋白酶酶解所需的酶切位點，破壞了蛋白質的三級結構，降低了蛋白質分子量，從而產生了多肽和游離氨基酸[19-20]。在口胃腸連續(xù)消化階段，不同試驗條件下的蛋白質含量和游離氨基酸含量驟增，ZQ組和GW組的粉劑游離氨基酸含量較高，WJ組的片劑游離氨基酸釋放效果較好。主要是在胃酸和胃蛋白酶的消化下，經以上方式處理的粉劑和片劑暴露出了大部分的胰酶的酶切位點[21]，同時腸道微堿pH值環(huán)境使存在的胰酶抑制劑失活，更多小分子多肽被降解。

消化前，WJ組的粉劑和GW組的片劑可溶性糖的釋放效果較好，但還原糖含量較低，且片劑的可溶性糖和還原糖含量遠遠低于粉劑，可能是由于片劑的處于擠壓狀態(tài)，且大量的螺旋藻分子被包埋。在口腔消化階段，不同試驗條件下的粉劑和片劑可溶性糖增加，但還原糖增加量不明顯，說明口腔消化環(huán)境基本不會降解可溶性糖分子量，因為唾液淀粉酶只能水解淀粉和部分碳水化合物α（1→4）的糖苷鍵[22]，而對絕大部分碳水化合物并不消化。在口胃連續(xù)消化階段，不同試驗條件下的粉劑和片劑可溶性多糖和還原糖含量增加，其中GW組和SJ組的粉劑以及WJ和SJ組的片劑可溶性糖和還原糖含量較高。主要是因為胃液中超低的pH值環(huán)境，造成了螺旋藻細胞壁的破壞，釋放出較多可溶性糖，而還原糖含量的驟增也是因為酸性環(huán)境導致可溶性糖的相對分子量降低，導致大分子糖類的糖苷鍵斷裂和還原末端形成[23]。在口胃腸連續(xù)消化階段，各試驗條件下的粉劑和片劑可溶性糖驟增，但還原糖含量的變化不大。閔芳芳等[24]認為主要是多糖在腸道環(huán)境中的絮狀沉淀消失，導致多糖易發(fā)生聚集。

3.2 不同處理方式對螺旋藻抗氧化活性的影響

抗氧化體系具有多種檢測方式，DPPH自由基清除率測定是最常用的一種。在口腔消化階段，粉劑和片劑的抗氧化活性未發(fā)生很大變化。在口胃連續(xù)消化階段，各處理組的粉劑和片劑DPPH自由基清除率較口腔消化階段增加，其中SJ組的DPPH自由基清除率最高。主要原因可能是胃液酸性環(huán)境和胃蛋白酶導致多酚黃酮類物質與蛋白質氨基酸殘基或氨基、巰基形成的共價鍵或非共價鍵斷裂，使多酚和黃酮類物質轉換成游離態(tài)，還有蛋白質的二級和三級結構遭到破壞，共價鍵發(fā)生斷裂，降解形成具有抗氧化活性的小分子多肽，以及胃消化階段可溶性糖的大量釋放促進了整個抗氧化系統(tǒng)的升高[25-27]。在口胃腸消化階段，各處理組的粉劑和片劑DPPH自由基清除能力繼續(xù)增強。雖然腸道環(huán)境中pH值升高會導致部分多酚的結構發(fā)生改變，部分多酚氧化成醌類物質[28]，但粉劑和片劑的可溶性糖含量在腸消化后驟增，這導致了腸消化的整個抗氧化活性的增強。

本研究探討了不同方式處理后的螺旋藻粉劑和片劑的整個體外模擬消化過程，結果表明，經口胃腸連續(xù)消化后，高壓蒸汽處理的粉劑游離氨基酸釋放效果最好，高溫處理的粉劑可溶性蛋白釋放效果最佳，酸解和高溫處理后的粉劑可溶性糖和還原糖釋放效果較好，水解處理的片劑游離氨基酸、可溶性蛋白、可溶性多糖釋放較好；螺旋藻的游離氨基酸主要在胃、腸消化后釋放，可溶性多糖主要在腸消化后釋放；酸解處理的粉劑抗氧化效果較好，而水解處理的片劑抗氧化效果較好，且在口胃腸連續(xù)消化后螺旋藻抗氧化效果發(fā)揮最佳。本研究對螺旋藻的生產加工具有指導性意義。