香芹酚和月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽聯用對熒光假單胞菌抑菌作用的研究

李瑋瑋，蔡天舒*，冀霞，潘銳，黃晴，謝艷慧

（1.惠州衛生職業技術學院，廣東 惠州 516025；2.惠州學院，廣東 惠州 516007）

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一種假單胞菌屬的革蘭氏陰性菌，易造成低溫冷藏食品的污染，是水產品[1]、乳制品[2]、肉制品[3]等產品中的優勢腐敗菌。該菌的生長迅速，所產生的胞外蛋白酶和脂肪酶會加速食品中蛋白質和脂肪的水解，造成食品腐敗變質[2]，感官可接受度下降，甚至喪失可食用價值，導致嚴重的經濟損失。此外，熒光假單胞菌還可引起敗血癥、感染性休克和血管內凝血等疾病，對人類健康造成威脅[4]。因此，有效抑制食品中的熒光假單胞菌，對延長食品貨架期和提升食品質量安全具有重要意義。

天然防腐劑因具有安全、無毒、抗菌譜廣等優勢，已成為食品抑菌防腐領域研究的熱點[5]。香芹酚作為一種良好的天然防腐劑，已被美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）列為公認安全的食品成分（generlly recognized as safe，GRAS）[6]。香芹酚生物學特性廣泛，如抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、調節免疫反應和調節腸道微生物群[7]。研究發現香芹酚對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單核增生李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌等食品中常見的食源性致病菌均具有抑制作用[7]。然而，其溶解性差的特點，則制約了其在食品抑菌防腐保鮮中的應用。

月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽（ethyl-Nα-lauroyl-L-arginate hydrochloride，LAE）是一種陽離子型表面活性劑，水溶性強，對霉菌、酵母菌、革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌等多種微生物表現出強烈的抗菌活性[8]。研究證實，LAE作為食品添加劑安全性較高，易在體內分解成月桂酸和L-精氨酸等天然成分[8]。2005年，LAE被FDA批準為GRAS類食品添加劑[8]。目前，已有學者將LAE應用于果蔬、肉制品、水產品等相關防腐保鮮研究中[8]。但香芹酚與LAE聯合對熒光假單胞菌的抑菌效果與機制尚未被探索。

因此，本試驗皆在探索一種基于香芹酚的新型復合食品抑菌劑，即建立香芹酚與LAE聯用對熒光假單胞菌的最佳抑菌濃度模式，增強其生物利用度、評估抑菌效果；探討香芹酚與LAE聯用潛在的抑菌作用機制，綜合評價其作用模式，從而為擴展其在食品工業中抑菌、防腐領域的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熒光假單胞菌ATCC 13525：廣東環凱微生物科技有限公司。

營養瓊脂、營養肉湯、瓊脂：北京陸橋技術有限公司；香芹酚（分析純，99.07%）：上海阿拉丁有限公司；月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽（化學純，≥97%）：成都傲飛生物化學品有限責任公司；細菌蛋白質提取試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、蛋白質Marker、戊二醛、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、葡萄糖、無水乙醇（分析純）、考馬斯亮藍染色液、1%結晶紫染色液、冰乙酸（分析純）、96孔板：上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；HR60-IIA2生物安全柜：青島海爾特種電器有限公司；HZQ-F160型振蕩培養箱：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；Infinite M200 Pro NanoQuant多功能酶標儀：瑞士TECAN公司；Nano－Drop2000分光光度計：美國賽默飛公司；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡：日本JEOL公司；GelDoc XR+全自動凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司；Eppendorf 5418R離心機：德國艾本德股份公司。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌濃度測定

采用二倍稀釋法分別測定香芹酚和LAE的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）[9]。將熒光假單胞菌接種至無菌營養肉湯，30℃、120 r/min條件下振蕩培養16 h，6 000 r/min離心10 min，棄上清液保留菌體沉淀。用新鮮無菌營養肉湯重懸菌體，調整菌液濃度約為107CFU/mL備用。將各質量濃度的香芹酚和LAE分別取100 μL加入96孔板中，取100 μL菌液分別加入到已裝有不同濃度的香芹酚和LAE溶液中，使香芹酚的終濃度分別為8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063 mg/mL，LAE 溶液的終濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2 μg/mL。對照組加入100 μL營養肉湯和100 μL菌液。將樣品置于30℃下培養24 h，在600 nm波長處測定OD值，以細菌生長被抑制的最低抑菌濃度作為MIC。

1.3.2 聯合抑菌效應的測定

以“棋盤法”[9]確定香芹酚與LAE的最佳聯合抑菌組合。將香芹酚與LAE分別用營養肉湯稀釋至質量濃度為各自的1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC和8 MIC。在96孔板中，從左至右，濃度由低至高依次加入50 μL香芹酚溶液，同列中香芹酚濃度相同。同時由上至下，從低濃度至高濃度依次加入50 μL LAE溶液。然后在每孔中均加入100 μL濃度為107CFU/mL的熒光假單胞菌懸液，并充分混勻，使試驗組中每孔含有不同濃度的抑菌劑組合。對照組加入100 μL營養肉湯和100 μL菌液。將樣品置于30℃下培養24 h，檢測OD600值，確定兩種抑菌劑聯用時的MIC。以部分抑菌濃度指數（fractional inhibitory concentration index，FICI）判定兩種抑菌劑的聯用效果，計算公式如下。

結果判定依據：FICI≤0.5為協同作用；0.5＜FICI≤1為相加作用；1＜FICI≤2為無關作用；FICI＞2為拮抗作用[9]。

1.3.3 生長曲線繪制

參考舒慧珍等[10]的方法繪制生長曲線。用營養肉湯將熒光假單胞菌培養并稀釋至濃度約107CFU/mL，備用。依據聯合抑菌效應的測定結果，在96孔板中，每孔中加入菌液100 μL，然后加入100 μL的香芹酚和LAE溶液，使終濃度分別為1/2 MIC香芹酚、1/16 MIC LAE、1/2 MIC 香芹酚+1/16 MIC LAE。以加入 100 μL營養肉湯和100 μL菌液作為對照。將樣品置于30℃培養24 h，每2 h測定一次OD600值，并以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制生長曲線。

1.3.4 胞外蛋白質和核酸的測定

參照Cao等[11]的方法測定胞外蛋白質和核酸，并稍作修改。將熒光假單胞菌培養至對數期，6 000 r/min離心10 min后收集沉淀，并以1×PBS清洗、重懸和調整菌體濃度至OD600=1.0。向上述熒光假單胞菌懸液中加入抑菌劑，使終濃度分別為0（對照）、1/2 MIC香芹酚、1/16 MIC LAE、1/2 MIC 香芹酚+1/16 MIC LAE，于30℃、120 r/min條件下振蕩培養3 h。期間分別于0、30、60、90、120、150、180 min收集培養液，以4 ℃、8 000 r/min離心5 min，吸取上清液并用分光光度計分別檢測OD260和OD280。

1.3.5 透射電子顯微鏡進行細菌形態觀察

采用透射電子顯微鏡結合超薄切片技術[11]，觀察熒光假單胞菌細胞形態變化。向培養至對數期的菌懸液中分別加入終濃度為1/2 MIC香芹酚、1/16 MIC LAE、1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE的抑菌劑，以未加抑菌劑處理組作為對照，30℃下振蕩培養3 h，取培養液6 000 r/min離心10 min，以1×PBS清洗并調整至OD600值為1.0。向上述菌體處理液加入等體積的5%戊二醛溶液，在4℃條件下固定16 h。樣品經1×PBS清洗3次，去除固定液，用乙醇溶液梯度逐級脫水、包埋、加溫聚合、超薄切片機切片、醋酸鈾-硝酸鉛染色后，以透射電子顯微鏡觀察細菌形態。

1.3.6 細菌胞內蛋白質含量的測定

根據耿一鳴等[12]的方法并加以修改。將培養至對數期的熒光假單胞菌懸液，離心后用1×PBS清洗、重懸，調節至OD600=1.0。加入香芹酚和LAE，使其在菌液中的終濃度分別為0、1/2 MIC香芹酚、1/16 MIC LAE、1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE，于30℃振蕩培養3 h，提取不同處理組中的菌體蛋白質，并以BCA法于OD562下測定蛋白質濃度。

菌體蛋白與5×蛋白上樣緩沖液混合，100℃沸水浴5 min，瞬時離心，取等體積上清液進行十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。濃縮膠恒壓80 V、分離膠電壓120 V，0.1%考馬斯亮藍染色30 min，脫色液脫色至蛋白質條帶清晰，并拍照分析[13]。

1.3.7 生物被膜的形成

參照戴雨蕓等[14]的方法，將熒光假單胞菌接種至營養肉湯，30℃培養16 h，6 000 r/min離心10 min后，棄上清液保留菌體沉淀。用無菌營養肉湯重懸菌體，調整菌液濃度至OD600=1.0，再用含0.2%葡萄糖的營養肉湯將上述菌液稀釋100倍。加入香芹酚和LAE，使其在菌液中的終濃度分別為0、1/2 MIC香芹酚、1/16 MIC LAE、1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE。取上述菌液160 μL加入圓底96孔板，30℃培養24 h。依次吸去96孔板中的菌液，用無菌水洗3次，吸干。加入170 μL 0.1%結晶紫染色15 min，以無菌水洗3次后吸干。最后加入180 μL 33%冰乙酸溶液充分溶解后，測定595 nm處OD值。

1.3.8 香芹酚和LAE對熒光假單胞菌群集與泳動的影響

參照劉楠[15]的方法，并稍作修改。配制群集瓊脂基礎培養基和泳動瓊脂基礎培養基，冷卻至46℃，向上述兩種基礎培養基中分別加入不同濃度的香芹酚和LAE，充分混勻制備固體平板，使培養基內的抑菌物終濃度分別為0、1/2 MIC香芹酚、1/16 MIC LAE、1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE。將5 μL熒光假單胞菌液滴加于固體平板中央，無菌風吹干，30℃培養24 h，觀察菌株的遷移情況。并分別測量熒光假單胞菌在群集培養基、泳動培養基中的面積。

1.4 數據統計與分析

每組試驗平行進行3次，結果采用GraphPad Prism 8.0繪圖，兩組計量數據比較采用Student's t檢驗統計學分析，P＜0.05或P＜0.01表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 香芹酚和LAE對熒光假單胞菌的抑菌效應

2.1.1 香芹酚和LAE對熒光假單胞菌的MIC測定

不同濃度的香芹酚和LAE分別對熒光假單胞菌的生長抑制情況見表1。

表1 香芹酚與LAE對熒光假單胞菌的抑制作用Table 1 Activity of carvacrol and LAE against P.fluorescens

由表1可知，當香芹酚濃度≥0.500 mg/mL時，熒光假單胞菌未見生長，菌液呈澄清狀態；且當香芹酚濃度=0.500 mg/mL 時，光密度變化值（△OD600）＜0.05，說明香芹酚對熒光假單胞菌的MIC為0.500 mg/mL。這與Fang等[6]的研究結果一致。同時，表1結果顯示LAE對熒光假單胞菌的MIC為64 μg/mL。綜上表明，香芹酚和LAE對熒光假單胞菌的生長均有抑制作用，且抑菌能力有濃度依賴性。

2.1.2 香芹酚和LAE對熒光假單胞菌的聯合抑菌作用

根據“棋盤法”進行聯合抑菌效果的研究，找出最佳聯合抑菌濃度。不同濃度的香芹酚與LAE組合對熒光假單胞菌生長的影響見圖1。

圖1 香芹酚和LAE對熒光假單胞菌的聯合抑菌作用Fig.1 Synergy of carvacrol and LAE against P.fluorescens

由圖1可知，當細菌培養液中香芹酚濃度為0.250 mg/mL（1/2 MIC）、LAE 濃度為4 μg/mL（1/16 MIC）時，作用24 h后，菌液澄清，平板涂布無細菌生長，抑菌率為100%。通過FICI公式計算，1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE的FICI值為0.56，該組合具有相加作用，表明香芹酚與LAE的聯合應用可以有效降低獨立作用劑量。

香芹酚水溶性差，國內外研究學者主要采用磷脂[16]、多糖[17]和β-環糊精[6]等物質將其包埋，以解決其溶解性差的問題。研究表明，LAE有助于增溶丁香酚，促進其與微生物表面的接觸，使丁香酚能夠更好地接觸磷脂膜，具有協同抑菌活性[18]。LAE可以提高百里香酚納米乳液的穩定性和抗菌功效[19]。本研究采用具有抑菌活性的陽離子表面活性劑LAE與香芹酚復配，利于抑菌生物活性的發揮，提高生物利用度，為雙組分抗菌乳液拓展在食品中的應用范圍提供參考。

此外，大鼠遺傳毒性研究顯示，香芹酚（81mg/kgBW～810 mg/kg BW）不會誘導體內基因毒性或氧化性DNA損傷，且無組織病理學變化，其作為食品防腐劑的潛在應用具有良好的特征[20]。同時，歐盟食品安全局對LAE作為食品添加劑的每日允許攝入量為0.5 mg/kg BW[21]。而本研究中所采用的香芹酚和LAE聯合抑菌劑量遠低于上述限量標準，符合食品安全要求，將在不同食品中發揮聯合抑菌效果。

2.1.3 香芹酚和LAE聯用對熒光假單胞菌生長曲線的影響

香芹酚和LAE聯合使用對熒光假單胞菌生長曲線的影響見圖2。

圖2 香芹酚和LAE聯合對熒光假單胞菌生長曲線的影響Fig.2 Effect of carvacrol and LAE on the growth of P.fluorescens

由圖2可知，對照組的細菌生長旺盛，4 h時進入對數生長期，細菌快速生長，24 h時細菌濃度OD600為0.795；當培養基中分別加入終濃度為1/2 MIC香芹酚、1/16 MIC LAE時，24 h時細菌濃度OD600分別為0.394和0.646；當1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE聯用時，培養基未出現渾濁，菌體未見生長。與對照相比，24 h處理后，1/2 MIC香芹酚抑菌率為56.3%（P＜0.05），1/16 MIC LAE抑菌率為24.1%（P＞0.05），1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE聯合抑菌率達97.9%（P＜0.01）。結果表明，香芹酚和LAE聯合作用，對熒光假單胞菌的生長抑制能力最強，抑菌效果顯著，表現出良好的聯合抑菌效應。

2.2 香芹酚和LAE聯用對熒光假單胞菌的抑菌機制

2.2.1 香芹酚和LAE聯用對菌體蛋白質和核酸泄漏的影響

細菌細胞質膜完整是維持細菌生長的關鍵因素[22]。因此，本研究通過檢測菌體蛋白質與核酸胞外泄漏，分析細胞質膜的完整性。香芹酚和LAE聯用對菌體蛋白質和核酸泄漏的影響見圖3。

由圖3可知，對照組和1/16 MIC LAE處理組中胞外蛋白質（OD280）和核酸（OD260）含量隨時間變化不顯著（P＞0.05）；1/2 MIC香芹酚組和1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE聯用組中，處理1 h內均出現菌體蛋白和核酸泄露。其中，與對照相比，1/2 MIC香芹酚+1/16MIC LAE聯用組細菌懸液中的蛋白質和核酸泄漏顯著增加，吸光度OD280和OD260在1 h時分別升高31.2倍和17.5倍（P＜0.01），之后吸光度趨于穩定。上述研究表明，熒光假單胞菌經1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE處理后，細胞質膜快速發生不可逆損傷，導致膜通透性發生改變，菌體內大分子物質泄漏到培養液中，細胞膜完整性破壞。研究表明，萜類化合物可以通過破壞細菌細胞壁的脂質組裝，造成細胞膜的崩解、細胞蛋白質的變性、細胞質物質的泄漏，最終導致細胞裂解和死亡[22]。LAE主要通過與革蘭氏陰性菌外膜中的脂多糖相互作用，使膜去極化，破壞菌體滲透屏障和完整性，抑制細菌生長[18]。

圖3 香芹酚和LAE聯用對熒光假單胞菌胞內蛋白質和核酸的泄漏的影響Fig.3 Effect of the combination of carvacrol and LAE on release of intracellular proteins and nucleic acids from P.fluorescens

2.2.2 透射電子顯微鏡觀察香芹酚和LAE聯用對細菌形態的影響

通過透射電子顯微鏡觀察熒光假單胞菌經香芹酚和LAE聯合處理后菌體超微結構的改變，結果見圖4。

由圖4可知，對照組菌體結構完整，邊界清晰，細胞質分布均勻，飽滿。1/2 MIC香芹酚處理組和1/16 MIC LAE處理組，菌體結構相對完整，部分菌體細胞質電子密度下降，不均勻。1/2 MIC香芹酚+1/16MIC LAE聯用組細菌形態不規則，邊界褶皺，細胞質電子密度顯著下降。有研究發現，檸檬烯[10]可促進熒光假單胞菌體裂解，細胞壁和細胞膜結構破壞，大分子物質泄漏，菌體形態發生改變。LAE主要的抑菌機制是破壞細胞膜，但未導致細胞裂解[8]。結合本試驗結果表明，香芹酚和LAE聯用促進熒光假單胞菌的菌體結構破損，導致細胞內容物泄漏，從而抑制細菌生長。

圖4 熒光假單胞菌的透射電鏡圖（50 000×）Fig.4 Transmission electron micrographs of P.fluorescens（50 000×）

2.2.3 香芹酚和LAE聯用對胞內蛋白質的影響

香芹酚和LAE聯用對胞內蛋白質的影響見圖5。

圖5 香芹酚與LAE聯用對熒光假單胞菌胞內總蛋白濃度的影響與SDS-PAGE電泳圖Fig.5 Effect of carvacrol combined with LAE on intracellular protein content and SDS-PAGE profile of P.fluorescens

由圖5可知，與上述胞外蛋白質和核酸泄漏測定結果，以及透射電子顯微鏡觀察結果相一致，與對照組相比，1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE聯用組中，熒光假單胞菌胞內蛋白濃度顯著下降，降低了84.1%（P＜0.01），1/2 MIC香芹酚處理組降低了32.1%（P＜0.01），而1/16 MIC LAE處理組無顯著變化（P＞0.05）。通過SDS-PAGE進一步分析胞內可溶性蛋白質含量的改變（圖5b），對照組蛋白質電泳條帶豐富且清晰（泳道A）；1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE聯用組中，所有蛋白質條帶亮度明顯減弱，甚至消失，僅剩4條微弱的條帶，主要位于135、35、25 kDa和17 kDa（泳道B）。

綜合上述研究結果表明，在1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE作用下，熒光假單胞菌所表達的蛋白質含量和類型減少，進一步揭示香芹酚和LAE聯合作用破壞熒光假單胞菌細胞膜結構完整性，導致細菌體內蛋白質泄漏，使得胞內蛋白質合成受阻。研究表明，松油烯-4-醇[12]、檸檬烯[10]和苯乳酸[13]等抑菌劑也具有相似的抑菌機制，即通過改變熒光假單胞菌細胞膜的通透性，導致大分子蛋白泄漏。

2.3 香芹酚和LAE聯用對熒光假單胞菌生物被膜形成的影響

生物被膜是細菌處于外界不利環境時，細菌以及其自身所分泌的聚合物所形成的一種聚集膜狀物[23]。研究表明，生物被膜的形成將有效保護細菌，使其對抗菌劑以及機體免疫系統的抵抗性顯著增強，加劇食品的污染[23]。香芹酚和LAE聯用對熒光假單胞菌生物被膜形成的影響見圖6。

圖6 香芹酚和LAE聯用對熒光假單胞菌生物被膜形成能力的影響Fig.6 Effect of the combination of carvacrol and LAE onbiofilmforming ability of P.fluorescens

由圖6可知，與對照相比，1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE、1/2 MIC香芹酚、1/16 MIC LAE分別作用24 h后，熒光假單胞菌生物被膜總量分別減少97.0%（P＜0.01）、61.5%（P＜0.01）、3.9%（P＞0.05）。其中，香芹酚和LAE聯用對熒光假單胞菌生物被膜的形成有顯著抑制效果。戴雨蕓等[14]研究發現，香芹酚對金黃色葡萄球菌生物被膜有明顯的抑制和清除作用，主要通過抑制相關基因轉錄調控細胞間多糖黏附素的合成和胞外DNA的釋放，減少生物被膜的形成。丁香酚破壞副溶血性弧菌細胞間連接，分離生物膜，并減少生物膜中的活菌細胞，具有顯著的抗生物膜活性[24]。

2.4 香芹酚和LAE聯用對熒光假單胞菌群集運動和泳動的影響

熒光假單胞菌是一種具有鞭毛的革蘭氏陰性菌，具有鞭毛介導的細菌群集、泳動兩種遷移方式，分別代表細菌的群體行為與個體行為[25]。細菌的運動特性對細菌在宿主表面定植和后繼生物膜的形成具有重要作用[25]。香芹酚和LAE聯用對熒光假單胞菌群集與泳動的影響及運動抑制情況見圖7和圖8。

由圖7和圖8可知，與對照相比，1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE聯用對熒光假單胞菌群集和泳動的抑制率最大，分別為92.5%和65.0%。說明香芹酚和LAE聯用能有效抑制熒光假單胞菌的遷移能力，且與上述抑制生物膜形成的結果相互驗證。已有研究表明，香芹酚在轉錄水平調控熒光假單胞菌鞭毛形成和群體感應信號分子酰基-高絲氨酸內酯的產生，從而抑制群體感應系統，調節群集運動[15]。

圖7 香芹酚和LAE聯用對熒光假單胞菌群集和泳動的影響Fig.7 Effect of the combination of carvacrol and LAE on swarming and swimming of P.fluorescens

圖8 香芹酚和LAE聯用對熒光假單胞菌運動面積的影響Fig.8 Effect of the combination of carvacrol and LAE on area of the motility zone of P.fluorescens

3 結論

香芹酚和LAE對熒光假單胞菌均具有良好的抑菌活性，MIC分別為0.500 mg/mL和64 μg/mL。棋盤法試驗結果表明，1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE聯用具有相加抑菌效果，FICI值為0.56，有效降低各自獨立作用的劑量。1/2 MIC香芹酚+1/16 MIC LAE聯用使熒光假單胞菌的細胞膜通透性明顯增強，主要表現為蛋白質和核酸泄漏、胞內電子密度下降及胞內蛋白質含量和類型減少。因此，香芹酚與LAE聯用誘導熒光假單胞菌的細胞壁和細胞膜完整性受損、超微結構改變、膜功能異常，導致蛋白質、核酸等生物大分子物質泄漏，使細菌新陳代謝活性下降，菌體死亡。此外，香芹酚和LAE聯用對熒光假單胞菌的生物膜形成、群集運動和泳動均有顯著的抑制作用，具有抑制群體感應活性的作用。