辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的制備工藝研究

王藝瑾，歐陽茜茜，盛軍，田洋*

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.食藥同源資源開發與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650201；3.云南省生物大數據重點實驗室，云南 昆明 650201；4.廣東醫科大學海洋醫藥研究院，廣東 湛江 524023；5.廣東湛江海洋醫藥研究院，廣東 湛江 524023）

辣木籽（Moringa oleifera seed）是辣木中的可食用部分之一，蛋白質及脂質含量占比高，具有較高的營養價值[1]，含有多種活性成分，如黃酮類、皂苷類、多糖類等[2-4]。辣木籽的活性成分之一異硫氰酸酯，是一類廣泛存在于十字花科植物中的天然活性物質，具有良好的抗腫瘤、抗氧化、抗炎、神經保護、組織保護等活性[5-8]，辣木籽異硫氰酸酯的糖苷配基部分中有一個額外的鼠李糖結構，相較其他十字花科中的異硫氰酸酯[9-11]，具有相對高的穩定性。但相比其他活性物質，辣木籽提取出的異硫氰酸酯類化合物在常溫及光照條件下易降解[12-14]，導致該活性物質的生物利用率普遍較低。為保護辣木籽異硫氰酸酯的生物活性，提高其生物利用率，本文采用柔性脂質體技術包裹辣木籽異硫氰酸酯，制備辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體，以期為植物提取活性成分柔性脂質體的制備提供方向，提高天然活性成分的生物利用率，同時為辣木的高值化利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木籽異硫氰酸酯：云南農業大學云南省生物大數據重點實驗室自制；大豆卵磷脂：阿偉拓（上海）醫藥科技有限公司；膽固醇、膽酸鈉、甲醇（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；二氯甲烷（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；三氯甲烷（分析純）：成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

CR-100S超聲清洗儀：深圳市春霖清洗設備有限公司；A360型紫外可見分光光度計：翱藝儀器（上海）有限公司；YRE-2000E旋轉蒸發儀：鞏義市予華儀器有限責任公司；THZ-300搖床：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的制備方法

采用薄膜分散法制備辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體。將卵磷脂、膽固醇、膽酸鈉溶于甲醇和三氯甲烷（1∶1，體積比）的混合液，使用超聲清洗儀超聲助溶，待溶解完全，轉移至圓底燒瓶，于37℃真空條件下旋轉蒸發除去有機溶劑形成磷脂薄膜。

將異硫氰酸酯-二氯甲烷（0.5 mmol/L）溶液加入到含有磷脂薄膜的圓底燒瓶，置于搖床中，25℃避光條件下，用10 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH7.5）水化 12 h，得到異硫氰酸酯粗柔性脂質體懸濁液。將異硫氰酸酯粗柔性脂質體懸濁液再次旋轉蒸發（25℃）除去二氯甲烷，超聲清洗儀超聲使辣木籽異硫氰酸酯在柔性脂質體懸浮液中均勻分布，最后置于4℃避光保存。

1.3.2 辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的包封率測定

1.3.2.1 辣木籽異硫氰酸酯標準曲線的建立

精確稱取辣木籽異硫氰酸酯311 mg，放入容量瓶中用二氯甲烷定容到100 mL，得到質量濃度為10 mmol/L的異硫氰酸酯溶液。之后再分別梯度稀釋成 0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.175、0.200、0.550 mmol/L的標準溶液，以二氯甲烷為空白對照，于236 nm處測量其吸光度，得到標準曲線A=5.088 6C+0.032 7，R2=0.999。

1.3.2.2 辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體包封率的計算

辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的包封率采用低溫超速離心法計算。將柔性脂質體用PBS稀釋3倍后，加入1.5 mL離心管中，按照柔性脂質體稀釋液∶甲醇=1∶2（體積比）加入甲醇，旋渦振蕩1 min，再超聲5 min，4℃下以15000 r/min離心30 min，離心結束后精密移取上清液1 mL檢測上清液的吸光度，再根據標準曲線方程計算異硫氰酸酯的濃度C。包封率（entrapment efficiency，EE）的計算公式如下。

式中：C總為加入異硫氰酸酯的濃度，mmol/L；C游為上清液中異硫氰酸酯的濃度，mmol/L。

1.3.3 單因素試驗

按照1.3.1的制備方法，選取卵磷脂與膽固醇質量比（2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1）、卵磷脂與膽酸鈉質量比（2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1）、超聲時間（2、4、6、8、10、12 min）3 個因素進行單因素試驗，探究各因素對辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體包封率的影響，每個因素平行試驗3次，取平均值。

1.3.4 Box-Behnken響應面法優化辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體制備工藝

在單因素試驗結果的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計方法，以包封率為響應值，進行響應曲面試驗設計，其因素與水平設計見表1。

表1 辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體Box-Behnken試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of box-behnken test for liposomes of isothiocyanate in Moringa oleifera seeds

1.3.5 辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的形態表征

1.3.5.1 粒徑分布及Zeta電位

取辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體1 mL，用蒸餾水稀釋至10 mL，適當超聲處理以防止微粒聚集影響測定結果，樣品測定前在25℃平衡2 min，采用粒徑分析儀測定柔性脂質體的粒徑分布、多分散性系數（polydispersity index，PDI）及Zeta電位。

1.3.5.2 透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察

取一滴辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體樣品滴在200目銅網上，室溫（25℃）下自然風干除去水分后置于透射電子顯微鏡下觀察。

1.3.6 體外釋放率測定

以PBS（pH7.5）作為釋放介質，精密量取辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體溶液10 mL至透析袋，將透析袋封口后置于40 mL的PBS中，室溫（25℃）下攪拌。分別于0、2、4、6、8……48 h每隔2 h取出4 mL釋放介質PBS，并補充相同體積的PBS，于236 nm處檢測辣木籽異硫氰酸酯的含量，每組試驗重復3次。體外釋放率計算公式如下。

式中：W1為異硫氰酸酯的釋放濃度，mmol/L；W0為柔性脂質體中異硫氰酸酯的總濃度，mmol/L。

1.4 數據處理

試驗指標的測定均重復3次，結果取平均值，數據采用Graphpad Prism5和Design Expert 8.0.6進行分析和繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 卵磷脂和膽固醇質量比的考察

卵磷脂與膽固醇質量比對辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體包封率的影響見圖1。

圖1 卵磷脂與膽固醇質量比對辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體包封率的影響Fig.1 Effect of lecithin and cholesterol mass ratio on the encapsulation efficiency of Moringa oleifera seed isothiocyanate liposome

如圖1所示，隨著卵磷脂質量增加，膽固醇質量的減少，辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的包封率總體呈逐漸增加的趨勢。當卵磷脂與膽固醇的質量比超過10∶1時，辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的包封率急劇減小。出現該結果的原因可能是膽固醇具有使柔性脂質體保持穩定，調節磷脂雙分子層柔韌性，使膜通透性降低，從而減少辣木籽異硫氰酸酯滲漏的作用[15]。在試驗中，當使用的卵磷脂與膽固醇質量比為2∶1時，膽固醇添加量超過膜負荷，因此包封率并不高；但隨著卵磷脂與膽固醇質量比增大，柔性脂質體體系穩定性發生改變，導致辣木籽異硫氰酸酯泄露。綜上所述，卵磷脂與膽固醇質量比應在10∶1附近較為合適。

2.1.2 卵磷脂與膽酸鈉質量比的考察

卵磷脂與膽酸鈉質量比對辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體包封率的影響見圖2。

如圖2所示，隨著卵磷脂與膽酸鈉質量比的增加，辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的包封率逐漸變大，當質量比為10∶1時辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的包封率最大；當卵磷脂與膽酸鈉質量比繼續增大時，包封率則驟然減小。導致該結果的原因是膽酸鈉可以加強柔性脂質體的柔性，是柔性脂質體制備中的柔軟劑，同時它也能降低柔性脂質體的粒徑。當卵磷脂與膽酸鈉的質量比達到閾值之后，過量的膽酸鈉使柔性脂質體變形，粒徑過小，從而使辣木籽異硫氰酸酯滲漏[16-17]，隨著膽酸鈉質量的減少，包封率逐漸變大，但當膽酸鈉質量太小時，柔性脂質體的包封率受到較嚴重的影響，包封率隨之大幅降低。由此可知，卵磷脂與膽酸鈉質量比10∶1為辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體制備的最佳單因素條件。

圖2 卵磷脂與膽酸鈉質量比對辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體包封率的影響Fig.2 Effect of lecithin and sodium cholate mass ratio on the encapsulation efficiency of Moringa oleifera seed isothiocyanate liposome

2.1.3 超聲時間的考察

超聲時間對辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體包封率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體包封率的影響Fig.3 Effect of ultrasound time on the encapsulation efficiency of Moringa oleifera seed isothiocyanate liposome

由圖3可知，隨著超聲時間的延長，柔性脂質體包封率呈先下降后上升再下降的趨勢，當超聲時間8 min時，柔性脂質體包封率最大；超聲時間8 min之后，隨著超聲時間的延長，柔性脂質體包封率反而減小。出現該結果可能是因為適當的超聲可以使團聚的柔性脂質體粒子逐漸分開，從而更好地包裹辣木籽異硫氰酸酯，但是過長時間的超聲，導致柔性脂質體粒子被過度振蕩而碎裂[18-19]；同時，隨著超聲時間的延長，溶液體系溫度升高，柔性脂質體體系穩定性減小，從而發生滲漏。因此，最佳的超聲時間在8 min左右。

2.2 響應曲面法優化辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體包封率

辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體包封率的Box-Behnken試驗方案與結果見表2。

表2 辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體包封率Box-Behnken試驗方案與結果Table 2 Experimental scheme and results of box-behnken Moringa oleifera seed isothiocyanate liposome encapsulation efficiency

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行多元回歸擬合，得到辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體包封率對卵磷脂與膽固醇質量比、卵磷脂與膽酸鈉質量比、超聲時間的二次多項回歸模型為Y=61.32-0.28A+0.49B-0.55C+0.082AB-1.26AC-0.21BC-2.36A2-1.60B2-2.35C2，R2=0.914。對回歸方程系數進行顯著性檢驗見表3。

表3 辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體包封率的方差分析Table 3 Variance analysis of Moringa oleifera seed isothiocyanate liposome encapsulation efficiency

續表3 辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體包封率的方差分析Continue table 3 Variance analysis of Moringa oleifera seed isothiocyanate liposome encapsulation efficiency

由表3可知，整體模型為極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明方程和試驗擬合較好，可以對辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體工藝進行預測。各因素對辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體包封率影響的排序為卵磷脂與膽酸鈉質量比（B）＞超聲時間（C）＞卵磷脂與膽固醇質量比（A）。圖4～圖6是根據回歸方程所做出的響應曲面和等高線圖，等高線及響應面圖能夠反映出各因素之間的交互作用以及各因素和響應值之間的關系，等高線呈圓形表示兩因素間的交互影響作用不顯著[20-21]。

圖4 卵磷脂與膽固醇質量比和卵磷脂與膽酸鈉質量比對柔性脂質體包封率影響的響應面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour diagram of the effect of lecithin-cholesterol mass ratio and lecithin-cholate mass ratio on liposome encapsulation efficiency

圖5 卵磷脂與膽固醇質量比和超聲時間對柔性脂質體包封率影響的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour diagram of the effect of lecithin-cholesterol mass ratio and ultrasound time on liposome encapsulation efficiency

圖6 卵磷脂與膽酸鈉質量比和超聲時間對柔性脂質體包封率影響的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour diagram of the influence of the mass ratio of lecithin-cholate and the ultrasound time on liposome encapsulation efficiency

由圖4可知，當卵磷脂與膽固醇質量比一定時，柔性脂質體包封率受卵磷脂與膽酸鈉質量比的影響不大，隨著卵磷脂與膽酸鈉質量比的增大，柔性脂質體包封率先增大后有所下降；而當卵磷脂與膽酸鈉質量比一定時，卵磷脂與膽固醇質量比對柔性脂質體包封率影響較大，包封率隨著卵磷脂與膽固醇質量比的增大先增大后減小。

由圖5可知，當卵磷脂與膽固醇質量比一定時，柔性脂質體包封率受超聲時間的影響不大，隨著超聲時間的延長，柔性脂質體包封率先增大后有所下降；當超聲時間一定時，卵磷脂與膽固醇質量比對柔性脂質體包封率影響也不大。

由圖6的響應面可知，在卵磷脂與膽酸鈉質量比為10∶1，超聲時間為8 min時，柔性脂質體的包封率可達到達到最大。從等高線圖可以看出，超聲時間軸向的等高線密集，說明超聲時間對柔性脂質體包封率影響較大，而卵磷脂與膽酸鈉質量比軸向的等高線相對稀疏，說明卵磷脂與膽酸鈉質量比對柔性脂質體包封率的影響較小。

2.3 模型驗證

通過軟件對模型進行分析，柔性脂質體的最佳制備工藝條件為卵磷脂與膽固醇質量比9.95∶1、卵磷脂與膽酸鈉質量比10.32∶1、超聲時間7.78 min。此條件下，柔性脂質體理論包封率為61.398 4%。

經過3次平行試驗，測得平均包封率為（64.17±2.19）%，與理論預測值相差2.78%，小于3%。表明采用響應面法優化得到的異硫氰酸酯柔性脂質體工藝可靠，具有一定應用價值。

2.4 辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的形態表征

2.4.1 粒徑分布及Zeta電位

圖7為辣木異硫氰酸酯柔性脂質體的粒徑分布和Zeta電位圖。

圖7 辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的粒徑分布和Zeta電位Fig.7 Size distribution and Zeta potential of Moringa oleifera seed isothiocyanate liposomes

圖7結果顯示，辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的平均納米粒徑為348 nm，多分散系數PDI為0.251，表明響應面優化后得到的辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體粒徑分散較為均一；Zeta電位圖顯示，該柔性脂質體Zeta電位為-24.7 mV，表示該柔性脂質體帶負電，且體系較為穩定。

2.4.2 透射電子顯微鏡觀察

圖8為辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的透射電鏡圖。

圖8 辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的透射電鏡圖Fig.8 Transmission electron micrograph of Moringa oleifera seed isothiocyanate liposomes

圖8結果顯示，包裹辣木籽異硫氰酸酯的柔性脂質體邊界清晰，為較圓整規則圓形，大部分柔性脂質體呈分散狀態，但有小部分柔性脂質體聚集。

2.5 辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的體外釋放率

辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的體外釋放率如圖9所示。

圖9 辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的體外釋放情況Fig.9 The cumulative release of Moringa oleifera seed isothiocyanate liposomes

根據辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的體外釋放曲線可以看出，在釋放開始的前12 h～14 h，異硫氰酸酯出現爆發式釋放，之后釋放速度減慢，在48 h內，累積釋放率達到80.105%左右，之后由于脫離柔性脂質體包裹后的異硫氰酸酯在自然環境下不穩定，因此釋放率在80%附近波動。這表明將辣木籽異硫氰酸酯做成柔性脂質體之后，可以對辣木籽異硫氰酸酯的釋放得到一定的控制，達到辣木籽異硫氰酸酯的緩釋作用。

3 結論

本試驗利用薄膜分散法制備脂溶性辣木籽異硫氰酸酯的柔性脂質體，通過Box-Behnken響應面法優化出辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的最佳制備工藝條件為卵磷脂與膽固醇質量比9.95∶1、卵磷脂與膽酸鈉質量比10.32∶1、超聲時間7.78 min，該條件下異硫氰酸酯脂質體的包封率為64.17%，模型方程高度顯著，擬合性良好。辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體的粒徑為348 nm，多分散系數為0.251，Zeta電位為-24.7 mV，其形態分布較為均勻。該柔性脂質體累積釋放率在0～14 h內出現爆發式釋放，之后釋放率保持在80.105%左右，辣木籽異硫氰酸酯柔性脂質體具有緩釋的效果。本研究將為植物提取活性成分柔性脂質體的制備提供依據，同時為各行業提供生物利用率高的新劑型奠定基礎。