降解亞硝酸鹽乳桿菌的篩選鑒定及其NiRs酶學性質

劉瑋，邱崇順，何宇星，段曉霞，其其日力格，烏云達來*

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.聯邦制藥（內蒙古）有限公司，內蒙古 巴彥淖爾 015000；3.蒙牛乳業（集團）股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 011599）

硝酸鹽和亞硝酸鹽廣泛存在于人們的日常生活中，如在蔬菜、水及食品當中[1-3]。亞硝酸鹽在肉制品加工中具有良好的發色、抗氧化和抑菌作用[4]，在保護人體心血管系統和胃黏膜以及代謝疾病中起著重要作用[5-7]。亞硝酸鹽可以與血液中的血紅蛋白結合，使血紅蛋白失去運輸氧氣的能力，導致組織吸收氧氣困難，出現典型的青紫和中毒癥狀[8]。當外界的亞硝酸鹽進入胃后，會與蛋白質分解產生的仲胺合成亞硝胺，從而使人患癌[9]。亞硝酸鹽可隨著孕婦的乳汁和胎盤進入胎兒體內，導致胎兒缺氧、皮膚青紫斑和先天性畸形[10]。此外，當人體一次性攝入0.3 g～0.5 g的亞硝酸鹽時就會中毒，超過3.0 g可致死亡[11]。因此尋找有效降解亞硝酸鹽的方法已成為近年來的研究熱點。

亞硝酸還原酶（nitrite reductase，NiRs）是催化亞硝酸鹽（nitrite，NIT）還原的一類酶，可降解NIT為NO或NH3，是自然界氮循環過程的關鍵酶[12]。按照反應物和輔助因子的不同，亞硝酸還原酶分為銅型亞硝酸還原酶（CuNiRs）、細胞色素cd1型亞硝酸還原酶（cd1NiRs）、多聚血紅素c亞硝酸還原酶（ccNiRs）和鐵氧化還原蛋白依賴的亞硝酸還原酶（FdNiRs）等類型[13]。在植物細胞內，NiRs在葉綠體或非綠色組織的質體中，存在于竹子、水稻等高等植物中的NiRs可以促進植物再生，提高愈傷組織的愈傷率[14]。在微生物蠟狀芽孢桿菌、胃幽門螺桿菌、銅綠假單胞菌中均發現了NiRs，含有NiRs的反硝化細菌能降解環境中的NIT，可用于污水處理[15-17]。多數乳酸菌是人體益生菌，可產亞硝酸還原酶，該酶可以應用于控制食品和飲用水中的亞硝酸鹽。當前國外研究者已從大麥葉片[18]、木糖氧化產堿菌[19]、藍細菌[20]和巨大芽孢桿菌[21]等中分離得到NiRs，并對其酶學性質進行了研究，而從植物乳桿菌中分離提純NiRs的研究還鮮有報道。借鑒于此，本研究以乳酸菌為研究對象，從中篩選出降解亞硝酸鹽能力最強的菌株，并對其NiRs進行分離純化和酶學性質研究，以期為今后進一步研究其降解亞硝酸鹽機理及NiRs應用研究提供良好的菌種資源和試驗數據。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料

197株供試菌株均分離自市售傳統發酵乳制品。

MRS液體培養基：蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、檸檬酸二銨2.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、結晶硫酸鎂0.6 g、無水乙酸鈉5.0 g、硫酸錳0.2 g、牛肉浸粉10.0 g，蒸餾水 1 000.0 mL。

MRS固體培養基：在MRS液體培養基的基礎上加入1.5%瓊脂。

1.2 試劑

DEAE-52、葡聚糖凝膠 G-150、透析袋（8 000～14 000）：北京Solarbio公司；亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸：國藥集團化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。HBI乳酸菌生化鑒定條：青島海博生物技術有限公司。

1.3 儀器

JH1102電子精密天平：深圳市三利化學品有限公司；DHP-908電熱鼓風恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；Eppendorf 5810R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；YXQ-LS-100SⅡ高蒸汽壓滅菌鍋：上海博迅實業有限公司；YC-1數控層析實驗冷柜：上海青浦滬西儀器廠；Qsonica Q500超聲波細胞破碎儀：美國Misonix公司。

2 方法

2.1 供試菌液的制備

將保存的乳酸菌接種于脫脂乳培養基中，凝固后，取一環接種于MRS液體培養基中，37℃培養12 h～24 h，傳代3次，保藏備用。

2.2 亞硝酸鹽標準曲線的制作

參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》制作亞硝酸鹽標準曲線[22]。

2.3 降解亞硝酸鹽菌株的篩選

將供試菌株接種于含100 mg/L亞硝酸鹽的MRS液體培養基中，接種量為2%，37℃培養24 h，按GB 5009.33—2016進行亞硝酸鹽含量的測定。

2.4降解亞硝酸鹽乳酸菌的鑒定

2.4.1 菌株的形態觀察

將篩選出的目的菌株在MRS固體培養基上劃線，37℃培養1 d～2 d，觀察菌落形態，挑選單個菌落進行革蘭氏染色，參照《常見細菌系統鑒定手冊》[23]做菌株形態鏡檢。

2.4.2 菌株的糖類發酵試驗

將目的菌株的供試菌液接種于分別含11種不同糖類的培養基中，37℃培養24 h～48 h，觀察目的菌株對11種糖類的利用情況，結果按照HBI乳酸菌生化鑒定條的說明進行判定。

2.4.3 菌株的分子生物學鑒定

對目的菌株的16S rDNA基因的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增參考段曉霞等[24]的方法，擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行測定，最后送至上海生工有限公司進行16S rDNA基因序列測序，將所測得的序列與NCBI中的BLAST分析進行比較，用MEGA-X軟件構建發育樹。

2.5 亞硝酸還原酶的分離純化

2.5.1 酶的純化

將目的菌株用MRS液體培養基活化3代后，以4%的接種量接種于含100 mg/L NaNO2的MRS液體培養基中，37℃培養12h，于4℃、5 000 r/min離心20 min后收集菌泥，取10 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.5，0.1 mol/L）使菌體懸浮，再次離心、洗滌2次，使用超聲波細胞破碎儀破碎菌體，于4℃、8 000 r/min離心20 min，上清液即粗酶液。將粗酶液先后用硫酸銨分級沉淀法，DEAE-52陰離子交換層析、Sephadex G-150柱層析進行酶的純化，冷凍干燥的酶純化制品于-4℃保存備用。

2.5.2 測定酶活力及酶蛋白質含量

參照文獻[25]測定酶活力，體系共250 μL：125 μL 0.1 mol/L PBS緩沖液（pH 6.5）、15 μL 0.1 mol/L NaCl、12.5 μL 0.1 mol/L NaNO2、0.1 mol/L 甲基紫晶 7.5 μL、50 μL 酶液、40 μL 0.1 mol/L Na2S2O4，混勻后于50 ℃反應20 min，劇烈振蕩至無色終止反應。酶活力單位定義：每分鐘還原1 μg亞硝酸鹽所需的酶量為一個酶活力單位。

酶蛋白質含量采用考馬斯亮藍法[26]測定。

2.5.3 酶的純度及相對分子量測定

參照文獻[27]對酶的純度及相對分子量進行測定。聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）條件：濃縮膠 5%，分離膠 12%；濃縮膠選用80 V固定直流電壓，待進入分離膠時改用120 V直流電壓。電泳結束后將膠取出，用考馬斯亮藍進行染色，脫色至電泳帶清晰可見。

2.6 亞硝酸還原酶的酶學性質研究

2.6.1 pH值對NiRs酶活及穩定性的影響

在pH值為5.0～8.0的條件下按照2.5.2的方法于50℃反應20 min，測定相對酶活力。將pH5.0～8.0的PBS緩沖液與酶液按體積比1∶1混勻，于4℃下放置2 h后測定相對酶活力。

2.6.2 溫度對NiRs酶活及穩定性的影響

在溫度為35℃～60℃條件下按照2.5.2的方法反應20 min，測定相對酶活力。將酶液于35℃～60℃條件下保溫6 h后，測定相對酶活力。

2.6.3 金屬離子與乙二胺四乙酸對NiRs酶活的影響

根據 2.5.2 中的方法，分別加入 Na+、Ca2+、Fe2+、Ba2+、Fe3+、K+和乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA），使金屬離子和EDTA的最終濃度分別為1、5、10 mmol/L，于50℃、pH 6.5條件下測定酶活，并和不添加任何金屬離子的酶活進行比較，計算相對酶活力。

2.6.4 米氏常數（Km）和最大反應速率（Vmax）的測定

配制不同濃度（1 mmol/L～5 mmol/L）的NaNO2溶液，在pH 6.5、50℃的條件下測定不同濃度下的酶促反應速度，采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法計算NiRs的Km值和Vmax。

2.7 數據處理

每個樣本均進行3次平行試驗，結果以均值±標準差表示；組間比較采用單因素ANOVA分析，部分數據采用SPSS 19.0軟件中的Duncan法進行顯著性分析。

3 結果與分析

3.1 亞硝酸鹽標準曲線

參照GB 5009.33—2016制作的亞硝酸鹽標準曲線回歸方程為y=0.779x-0.005，相關系數為R2=0.995，擬合度良好，可用于樣品中亞硝酸鹽含量的測定。

3.2 降解亞硝酸鹽菌株的篩選結果

將197株乳酸菌按2%接種量接種于含100mg/L亞硝酸鹽的MRS液體培養基中，培養24 h后測定其發酵液中的亞硝酸鹽含量，其中亞硝酸鹽降解率在90%以上的32株乳酸菌的結果見表1。

表1中32株乳酸菌的亞硝酸鹽降解率均在90%以上，其中菌株36的亞硝酸鹽降解率最高，且降解率為（96.36±0.37）%，因此將菌株36確定為目的菌株。張興吉等[28]從傳統發酵乳制品中分離出275株乳酸菌，其中50%的菌株表現出較好的亞硝酸鹽降解能力，平均在91.3%以上；程方方等[29]從傳統酸馬乳中分離出183株乳酸菌，共有28株乳酸菌具有亞硝酸鹽降解能力，其中菌株C27亞硝酸鹽降解率達88.91%。可見，從傳統發酵乳制品中分離的乳酸菌具有較高的亞硝酸鹽降解能力且具有較好的研究價值。

表1 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選Table 1 Screening of nitrite degrading lactic acid bacteria

3.3 降解亞硝酸鹽乳酸菌的鑒定結果

3.3.1 菌株的形態觀察

菌株36的菌落形態及細胞形態見圖1。

通過菌落形態觀察（圖1A）和菌株細胞形態（圖1B）得知，菌株36在MRS固體培養基上菌落呈圓形，邊緣整齊，表面光滑，顏色為白色，是一株革蘭氏陽性桿狀菌。

圖1 菌株36的菌落形態及細胞形態Fig.1 Colony and cell morphology of strain 36

3.3.2 菌株的糖類發酵試驗

菌株36的糖類發酵試驗結果見表2。

表2 菌株36的糖類發酵試驗Table 2 Sugar fermentation test of strain 36

由表2可知，菌株36可利用七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、乳糖和1%馬尿酸鈉，不能利用菊糖，菌株36的糖類發酵試驗結果與植物乳桿菌一致[30]，因此將菌株36初步鑒定為植物乳桿菌。

3.3.3 菌株的分子生物學鑒定

菌株36的16S rDNA基因序列發育樹見圖2。

圖2 菌株36的16S rDNA基因序列發育樹Fig.2 16S rDNA gene sequence development tree of strain 36

菌株36的16S rDNA基因序列長度為1 464 bp，在NCBI中登錄號為MN611150。經BLAST在線分析得知，菌株36與L.plantarum JCM 1149的同源性達100%，并且進化距離最近（圖2），而且菌株36的糖類發酵結果與植物乳桿菌一致，因此鑒定菌株36為植物乳桿菌。

3.4 亞硝酸還原酶的分離純化結果

3.4.1 酶的純化

NiRs的分離純化見圖3。

圖3 NiRs的分離純化Fig.3 Separation and purification of NiRs

菌株36的NiRs粗酶液先后用硫酸銨分級沉淀法，DEAE-52陰離子交換層析（圖3A）、Sephadex G-150柱層析（圖3B）等進行酶的純化，得到一個活力峰，將該活力峰下的酶液收集于同一管中，濃縮凍干后備用。

3.4.2 酶活力及酶蛋白質含量測定結果

酶活力及酶蛋白質含量測定結果見表3。

表3 酶活力及酶蛋白質含量Table 3 Determination of enzyme activity and enzyme protein content

由表3可知，菌株36的NiRs比酶活為99.35U/mg，回收率為15.50%，純化倍數為13.95。

3.4.3 酶的純度及相對分子量測定結果

NiRs的SDS-PAGE凝膠電泳圖見圖4。

圖4 NiRs的SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.4 SDS-PAGE gel electrophoresis of NiRs

純化后的NiRs經SDS-PAGE電泳結果（圖4）顯示為單一條帶，表明純化后的NiRs達到了電泳純，經蛋白標準曲線 y=-1.453 1x+2.520 7（R2=0.981 4），可計算得出NiRs的亞基相對分子質量約為47.8 kD。

3.5 亞硝酸還原酶的酶學性質

3.5.1 pH值對NiRs酶活力及穩定性的影響

不同pH值對NiRs相對酶活力和穩定性的影響結果見圖5。

圖5 pH值對NiRs相對酶活力及穩定性的影響Fig.5 The influence of pH value on the relative enzyme activity and stability of NiRs

由圖5A可知，當pH值在5.0～6.5內，隨著pH值的提高，NiRs相對酶活力逐漸升高；當pH值達6.5時，NiRs相對酶活力最強；當pH值在6.5～8.0內，隨著pH值的升高，NiRs相對酶活力逐漸降低，尤其pH值為7.5時，NiRs相對酶活力迅速降低至30.0%。由圖5B可知，pH值對NiRs穩定性的影響與圖5A變化趨勢一致，因此NiRs的最適pH值為6.5。龔鋼明等[31]對乳酸菌C2的NiRs進行酶學性質研究，結果發現乳酸菌C2的NiRs最適pH值為5.5，而菌株36的NiRs最適pH值要略高于乳酸菌C2，可能菌株差異所致，原因有待進一步研究。

3.5.2 溫度對NiRs酶活力及穩定性的影響

不同溫度對NiRs相對酶活力和穩定性的影響結果見圖6。

圖6 溫度對NiRs相對酶活力及穩定性的影響Fig.6 The influence of temperature on the relative enzyme activity and stability of NiRs

由圖6A可知，當溫度在35℃～50℃時，隨著溫度的升高，NiRs相對酶活力逐漸升高；當溫度達50℃時，NiRs相對酶活力最強；當溫度在50℃～60℃時，隨著溫度的升高，NiRs相對酶活力逐漸降低，尤其溫度達60℃時，NiRs相對酶活力迅速降低至9.37%。由圖6B可知，隨著溫度的升高，NiRs相對酶活力穩定性整體呈下降趨勢，當溫度在35℃～50℃時，NiRs相對酶活力維持在70%～100%之間，當溫度在50℃～60℃時，NiRs相對酶活力穩定性迅速降低。因此，將菌株36的NiRs最適溫度確定為50℃。據丁少南[13]對L.plantarum DS31的NiRs酶學性質研究，NiRs最適溫度為35℃，而菌株36的NiRs最適溫度為50℃，所以菌株36的NiRs耐熱性更好，有利于擴大其應用范圍。

3.5.3 金屬離子和EDTA對NiRs酶活的影響

金屬離子和EDTA對NiRs相對酶活力的影響見圖7。

由圖7可知，當金屬離子添加濃度在1 mmol/L～10 mmol/L 時，Fe2+、Fe3+和Ca2+對 NiRs酶活力有顯著激活作用（P＜0.05），1 mmol/L 和10 mmol/L的Na+以及10 mmol/L的Ba2+也有顯著激活作用（P＜0.05）；而1 mmol/L和5 mmol/L的Ba2+和K+對NiRs酶活力有顯著抑制作用（P＜0.05），但EDTA對酶活無顯著影響。

圖7 金屬離子和EDTA對NiRs相對酶活力的影響Fig.7 The influence of met al ions and EDTA on the relative enzyme activity of NiRs

3.5.4 Km值和Vmax的測定結果

以不同濃度的NaNO2為底物，在pH 6.5、50℃條件下測定NiRs的動力學參數。根據試驗數據求出不同底物濃度[S]下的反應速率[V]，以1/[S]為橫坐標，1/[V]為縱坐標，根據雙倒數作圖法得到NiRs的雙倒數曲線見圖8。

圖8 亞硝酸還原酶雙倒數曲線Fig.8 Nitrite reductase double reciprocal curve

由圖8可知，菌株36的NiRs的Km值為7.79 mmol/L，Vmax為5.84 mg/（L·min）。

4 結論

亞硝酸鹽含量過高一直是食品工業和消費者嚴重關注的問題之一。通過從197株乳酸菌中篩選出一株降解亞硝酸鹽能力最強的菌株36，測得其亞硝酸鹽降解率為（96.36±0.37）%。通過形態觀察及分子生物學鑒定得知菌株36為植物乳桿菌（L.plantarum）。最后將菌株36發酵液離心收集菌體，經細胞破碎和分級純化獲得NiRs，其比酶活為99.35 U/mg，回收率為15.5%且亞基相對分子質量約為47.8 kD，經酶學性質研究得知，該酶最適pH值為6.5，最適溫度為50℃，Km值為7.79 mmol/L，Vmax為5.84 mg/（L·min）；當金屬離子添加濃度為1 mmol/L～10 mmol/L 時，Fe2+、Fe3+和Ca2+對NiRs酶活力有顯著激活作用（P＜0.05），1 mmol/L和10 mmol/L的Na+以及10 mmol/L的Ba2+也有顯著激活作用（P＜0.05）。而 1 mmol/L 和5 mmol/L的Ba2+與 K+對NiRs酶活力有顯著抑制作用（P＜0.05），但EDTA對酶活無顯著影響。總之，具有較強降解亞硝酸鹽能力的植物乳桿菌36為今后降解亞硝酸鹽應用和NiRs基因表達研究提供理論依據及試驗材料。